彭及良 ，溫秀明 ，許瑞環(huán) ，沈磁石 ，何春輝

（1.廣東省深圳市龍崗區(qū)血站，廣東深圳 518172；2.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116）

近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應用方面的推廣，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測 HBV病毒載量已成為目前臨床診斷 HBV感染的常用指標，進一步提高了檢測的質(zhì)量。同時采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測乙型肝炎病毒HBV標志（HBV-M）簡便易行，一直為許多臨床科室使用。臨床上有必要把此兩種方法的檢測結(jié)果聯(lián)合起來進行分析，指導臨床應用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2009年6～9月來我院住院及門診的423例患者，年齡13～66歲。所有標本用無菌管留取血樣3 ml，于3 h內(nèi)分離血清，并凍存于20℃冰箱。

1.2 主要試劑

HBV-DNA定量診斷試劑由深圳市匹基生物技術(shù)公司提供。HBV-M測定用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），試劑由上?？迫A生物工程公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 ELISA法 按試劑說明書進行。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測HBV-DNA①樣本處理，取待測血清或血漿樣本以及試劑及試劑盒中的對照各100μl，分別加到0.5 ml離心管中，100μl DNA提取液1，振蕩混勻，13 000 r/min離心 10 s，25μl DNA 提取液 2，振蕩 10 s，200 r/min 離心 10 s，100℃干浴或沸水浴 10 s，13 000 r/min離心10 s，保留上清備用。②反應體系為40μl：37.6μl PCR反應液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。③循環(huán)條件為：37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s，60℃ 30 s 42 個循環(huán)。熒光信號收集在60℃。

1.3.3 污染的控制 標本的處理、試劑的配制、上樣及PCR擴增檢測嚴格分室進行，每次檢測均設強陽性、臨界陽性、陰性、質(zhì)控試劑參照品。

1.4 檢測儀器

美國ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR儀，芬蘭Labsystems生產(chǎn)的Multiskan MK 3酶標儀。

1.5 統(tǒng)計學方法

對所得數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg（+）組與 HBsAg（-）組 HBV-DNA 陽性率的比較

324例血清標本HBV-DNA表達情況見表1。

表 1 HBsAg（+）組與 HBsAg（-）組 HBV-DNA 陽性率的比較（%）Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg（+）group and HBsAg（-）group(%)

由表1可見，HBsAg（+）組HBV-DNA陽性率為78.4%，有21.6%的陰性率。HBsAg（-）組HBV-DNA陰性率為95.1%，有4.8%的陽性率，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結(jié)果

324例血清標本HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結(jié)果見表2。

表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結(jié)果Tab.2 Theresultsof HBV-DNA under HBV different serological makers

由表2可見血清HBsAg HBeAg HBcAb陽性組合HBVDNA陽性率為 100.0%，拷貝數(shù)達到 1.61×107拷貝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HB-cAb陽性率依次降低。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒已成為臨床常規(guī)。乙肝五項的檢測為臨床提供一定的信息[1-3]，但對HBsAg陰性者，本實驗發(fā)現(xiàn)有5%的 HBV-DNA陽性，且拷貝數(shù)在104拷貝/ml左右，與某些文獻報道相似[4-5]。其原因可能由于：①HBV發(fā)生變異，其前S區(qū)變異率比S區(qū)高2倍；前C/C區(qū)變異研究較多。②HbsAg的表達可能較低或其抗原性改變較大，用現(xiàn)有的試劑檢測不出。③形成免疫復合物，有人發(fā)現(xiàn)血中免疫復合物的存在可能影響HbsAg的檢出[6]。

乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)可真實反映HBV感染的狀況[7-9]，本試驗結(jié)果為 HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA全部陽性，平均含量為 1.61×107拷貝/ml；HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA 陽性率為 47.0%，平均含量為 3.42×104拷貝/ml；HBsAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA陽性率為69.0%，平均含量為6.32×104拷貝/ml，而 HBsAb（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA陽性率為5.2%，平均拷貝數(shù)為4.12×104拷貝/ml，由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與其血清學指標組合是相匹配的，對乙型肝炎的臨床診斷，特別是對其療效有較大的指導意義[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)HBsAg（+）HB cAb（+）的陽性率為 69.0%，比 HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的陽性率（47.0%）高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有兩種可能解釋，一是HBV復制減少或停止，一是HbsAg前C基因發(fā)生變異。根據(jù)Ferruccio Bonino來華報道，急性乙型肝炎時 HBV 標志物的變化圖顯示 HBsAg（+） HBeAb（+）HBcAb（+）時的 HBV-DNA 陽性率明顯低于 HBsAg（+）HBcAb（+）時的HBV-DNA陽性率。

本實驗所用的BIO-RADicycler熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高，操作簡單，克服假陽性結(jié)果，無需PCR后處理，防污染效果好，可直接反映病毒在體內(nèi)的存在情況，已為臨床普遍應用。血清學ELISA方法是檢測病毒侵染機體產(chǎn)生的免疫反應，間接反應病毒的感染狀況。對于 HBeAg與 HBV病毒載量之間的關系，一般認為兩者的水平存在一定程度的一致性。本試驗顯示兩者既有相關，又不盡一致，臨床上需要將兩者結(jié)合起來對患者進行診斷和治療。

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