朱新江* 張 凱 秦 偉 馮 祿

胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)胃癌病死率為25.2/10萬(wàn)（男性32.8/10萬(wàn)，女性17.0/10萬(wàn)），占全部惡性腫瘤死亡的23.2%（男性是女性的1.9倍），嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康。近幾年，表遺傳學(xué)改變的研究取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，成為胃癌臨床基礎(chǔ)研究的一個(gè)前沿陣地。p16基因是已經(jīng)確認(rèn)的最重要的抑癌基因之一，在胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用[1-3]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

表1 p16基因和GAPDH的RT- PCR引物序列及PCR條件

表2 p16基因甲基化和非甲基化引物序列及PCR條件

選擇2005年1月至2008年1月?lián)犴樖兄行尼t(yī)院普外科切除的胃癌患者50例，男44例，女6例，年齡40～74 歲，平均（58±9.76）歲。手術(shù)取下的新鮮標(biāo)本立即浸入液氮中后置于-70℃冰箱保存。 Wizard DNA cleap up 純化試劑盒（美國(guó)Promega公司），亞硫酸氫鈉（美國(guó)Sigma公司），SYBR GreenI 實(shí)時(shí)定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司），Taq酶和dNTP（日本TaKaRa公司）引物（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR分析胃腺癌標(biāo)本中p16基因MRNA的表達(dá)

用TRIzol 試劑一步法分別提取胃癌組織總RNA（按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)條件：首先進(jìn)行預(yù)變性，時(shí)間為4min，預(yù)變性溫度為93℃。預(yù)變性之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：溫度和時(shí)間分別為 92℃ 30s、51℃ 30s，71℃ 45s，最后延伸10min溫度為72℃。用瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，GB染色，利用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)PCR產(chǎn)物吸光度值，將各基因與GAPDH吸光度比值作為其mRNA水平的相對(duì)值，mRNA表達(dá)水平取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 甲基化特異性PCR檢測(cè)p16基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化

首先用酚-氯仿分別提取胃癌組織中基因組DNA，并用紫外分光光度儀進(jìn)行定性、定量。亞硫酸氫鈉修飾DNA后，純化，洗滌并離心基因組DNA。利用基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下：95℃12 min后，95℃變性30s，各種基因不同退火溫度退火45s，71℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)，74℃再延伸7min，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。結(jié)果經(jīng)Alpha Image 2000自動(dòng)成像儀成像采集數(shù)據(jù)，分析電泳結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定

基因組DNA經(jīng)過(guò)MSP擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果沒(méi)有出現(xiàn)甲基化條帶而出現(xiàn)非甲基化條帶，則該標(biāo)本p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生非甲基化；如果沒(méi)有出現(xiàn)非甲基化條帶而出現(xiàn)甲基化條帶，則該標(biāo)本p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化；甲基化條帶和非甲基化條帶同時(shí)出現(xiàn)，則該標(biāo)本p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生半甲基化（屬于甲基化）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0軟件分析，mRNA表達(dá)水平定量測(cè)定計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSP結(jié)果

見(jiàn)圖1。

MS-PCR檢測(cè)胃癌中p16基因甲基化狀態(tài)，M=206bp，U=206bp。M：甲基化：U：未甲基化：Pos：陽(yáng)性對(duì)照。Neg：陰性對(duì)照。DW：蒸餾水對(duì)照；Blank：標(biāo)本1，2為甲基化；標(biāo)本3，4為非甲基化。

2.2 RT-PCR結(jié)果

圖1 胃癌組織p16基因甲基化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析圖

50例胃腺癌中甲基化組p16基因mRNA表達(dá)量為（0.12±0.05），非甲基化組mRNA表達(dá)量為（0.77±0.13），甲基化組p16基因mRNA表達(dá)量明顯低于非甲基化組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1、表2。

3 討 論

生物基因組儲(chǔ)存著遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)兩種信息，遺傳學(xué)的信息決定著生物體細(xì)胞基因型；而表遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變的，可以通過(guò)細(xì)胞分裂進(jìn)行傳遞的信息，它參與基因表達(dá)調(diào)控，這種表觀遺傳修飾對(duì)于腫瘤的發(fā)生具有重大意義。DNA甲基化和組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等是表觀遺傳修飾的主要方式。其中DNA 甲基化是導(dǎo)致腫瘤最常見(jiàn)的表遺傳學(xué)事件，因而研究甲基化與腫瘤的關(guān)系成為目前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]。

p16基因又稱多腫瘤抑制基因（multiple tumorsuppressor，MTS）被認(rèn)為是最經(jīng)典的腫瘤抑制基因。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)科研[5,6]證實(shí)，p16基因甲基化與多種消化系統(tǒng)腫瘤特別是胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，他們的研究分為兩類：一類應(yīng)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶方法或MSP等方法研究胃癌細(xì)胞株或胃癌組織p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)現(xiàn)其甲基化率為30%～40%，且發(fā)生胃癌組織p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的樣本多不表達(dá)p16mRNA及p16 蛋白；另外一類研究體外應(yīng)用去甲基化劑5-deoxy-azacytidine對(duì)胃癌細(xì)胞處理后，可使胃癌細(xì)胞p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化而封閉的基因重新表達(dá)。上述的各項(xiàng)研究結(jié)果均有力的證明了p16基因CpG島甲基化可以導(dǎo)致p16mRNA及p16 蛋白表達(dá)缺失，去甲基化劑可恢復(fù)p16mRNA及p16 蛋白的表達(dá)證實(shí)該基因的甲基化是其失活的重要原因。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定胃腺癌組織中甲基化水平及mRNA表達(dá)的關(guān)系再次證實(shí)導(dǎo)致p16基因沉默的主要原因?yàn)镈NA甲基化，于國(guó)內(nèi)外的主流研究達(dá)成共識(shí)。p16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化導(dǎo)致p16基因沉默還可能在大腸癌，食管癌中有類似結(jié)果。胃癌在我國(guó)惡性腫瘤的病死率居于首位，主要原因在于50%的胃癌患者確診時(shí)已屬晚期，表遺傳學(xué)研究對(duì)胃癌的早期篩查及判斷癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著重要的意義，同時(shí)對(duì)于晚期胃癌目前的手術(shù)+化療的模式已無(wú)法從根本上提高晚期胃癌的五年生存率。而表遺傳學(xué)治療包括去甲基化及乙?；委焺倓偲鸩?，給腫瘤的治療帶來(lái)新的希望，但表遺傳學(xué)治療藥物在實(shí)體瘤應(yīng)用的某些機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。目前沒(méi)有一種基因藥物能有效抑制腫瘤，隨著對(duì)表遺傳學(xué)改變的認(rèn)識(shí)，對(duì)表遺傳學(xué)藥物的研究將為腫瘤的治療開(kāi)辟新的領(lǐng)域。

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