楊 揚(yáng)* 李乃卿

隨著分子生物學(xué)的深入研究，基因芯片作為基因組及后基因組時(shí)代的主要研究技術(shù)，已成為揭示藥物作用機(jī)制的重要方法。基因芯片檢測(cè)技術(shù)的前提是成功而適用的動(dòng)物模型，首先需要獲得足夠的RNA檢測(cè)量，所以成功的造模方法是研究課題成敗的關(guān)鍵所在。下面就我們近期進(jìn)行的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的造模方法總結(jié)如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡體質(zhì)量20～24g的BALB/C小鼠雄性（♂）81只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：京動(dòng)許字（2000）第004號(hào)總049號(hào)，在Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2 瘤株

小鼠結(jié)腸癌C26細(xì)胞株（美國(guó)引進(jìn)，廣安門醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。經(jīng)3次皮下接種傳代后，無(wú)菌條件下摘取瘤體，生理鹽水洗滌，剪成小塊，勻漿，離心后取沉淀，反復(fù)3次，培養(yǎng)于10%新生牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液（含青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL），置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中3d，每日換液。將細(xì)胞液機(jī)械吹打成單個(gè)細(xì)胞，離心取沉淀，加生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為7×105/mL，觀察細(xì)胞活力＞95%，備用。

1.2 方法

1.2.1 脾臟注射切脾法

隨機(jī)選取39只小鼠稱重，采用0.5%的戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術(shù)臺(tái)上。安爾碘皮膚消毒，左側(cè)腋后線肋緣下縱行切口，長(zhǎng)0.5～1cm，進(jìn)腹后于腹外側(cè)找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1mL注射器從脾下極進(jìn)針，將瘤細(xì)胞液0.2mL注射于脾內(nèi)，拔針后，酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5min，使瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝臟，注射區(qū)蒼白隆起消失后，結(jié)扎脾蒂，切除脾臟，查無(wú)出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚關(guān)腹。術(shù)后繼續(xù)在Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2.2 脾臟注射保脾法

造模小鼠42只稱重，采用0.5%的戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術(shù)臺(tái)上。安爾碘皮膚消毒，左側(cè)腋后線肋緣下縱行切口，長(zhǎng)0.5～1cm，進(jìn)腹后于腹外側(cè)找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1mL注射器從脾下極進(jìn)針，將瘤細(xì)胞液0.2mL注射于脾內(nèi)，拔出針頭后酒精棉球壓迫注射部位1～2min，查無(wú)出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚關(guān)腹。

造模后死亡1只，考慮失血過(guò)多致死。

2 結(jié) 果

造模后15d內(nèi)自然死亡小鼠35只，切脾組21只，保脾組14只，于第12天處死小鼠23只，切脾組8只，保脾組15只，第15天將剩余小鼠22只全部處死，切脾組10只，保脾組12只。切脾小鼠自然生存期11～15d，平均（13.05±0.71）d，保脾小鼠自然生存期9～15d，平均（11.64±1.49）d。

尸檢小鼠肝臟均有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為100%。切脾小鼠肝各葉皆布滿大小不一的瘤結(jié)節(jié)，大部分小鼠肝臟無(wú)正常肝組織，完全被腫瘤占據(jù)，肝重多3.5g以上，保脾小鼠脾內(nèi)腫瘤巨大，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶較少，肝臟形態(tài)、重量無(wú)明顯變化，大多數(shù)為散在的米粒大小瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移，最大瘤結(jié)節(jié)為0.8×0.5cm，肝重多為0.8g左右（圖1）。

3 討 論

圖1 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移造模對(duì)比

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為惡性腫瘤的第3位，肝臟是結(jié)腸癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，15%～25%的患者在確診已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，20%～35%的患者轉(zhuǎn)移灶僅出現(xiàn)在肝臟，50%～70%的晚期結(jié)腸癌患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，因此，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療日益受到臨床的重視。而尋找合適的動(dòng)物模型可以為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Kozlowski等[1]提出研究腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移的最佳模式是從脾臟內(nèi)植入瘤細(xì)胞，許勤等[2]同法用BALB/C小鼠脾內(nèi)注射小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞（CT26）造模成功率100%。左國(guó)華等[3]用BALB/C-nu/nu小鼠脾內(nèi)注射人結(jié)腸癌低分化腺癌細(xì)胞株LS174T制造肝轉(zhuǎn)移模型，成功率也達(dá)到100%。韓斌[4]將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT26）懸液接種于615小鼠脾被膜下建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為93.33%。

脾臟注射瘤細(xì)胞液造模模擬了結(jié)腸癌根治術(shù)后血行轉(zhuǎn)移肝臟的途徑和過(guò)程，造模成功率高。脾臟注射后保脾小鼠肝轉(zhuǎn)移率為100%，但是，腫瘤多為散在的瘤結(jié)節(jié)，數(shù)目較小、體積較小，可能無(wú)法滿足較大組織量的檢測(cè)要求。同時(shí)，由于脾內(nèi)腫瘤較大，小鼠常較早死于脾內(nèi)腫瘤，無(wú)法滿足多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的需要。脾臟注射瘤細(xì)胞液切脾法則可獲得轉(zhuǎn)移腫瘤組織較多，能滿足各種檢測(cè)方法取材的需要，尤其是基因芯片檢測(cè)取材需近500mg組織，且小鼠生存時(shí)間較保脾組長(zhǎng)，可以滿足多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的取材。另外，在切斷脾蒂前將脾臟完全暴露，便于進(jìn)針注射及結(jié)扎、切斷脾蒂，避免了脾臟大出血，減少動(dòng)物造模的死亡率。

因此，小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立以脾臟注射瘤細(xì)胞液后切脾法最佳，尤其適用于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的基因組表達(dá)譜研究，可同時(shí)滿足檢測(cè)組織量及選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的要求。

[1] Kozlowski JM,Fidler IJ,Campbell DE,et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse[J] .Cancer Res,1984,44(8):3522-3529.

[2] 許勤,吳文溪,馬利民,等.小鼠結(jié)腸腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立[J] .實(shí)用癌癥雜志,2000,15(5):456-457.

[3] 左國(guó)華,葛海燕.人結(jié)腸癌裸小鼠肝轉(zhuǎn)移模型的建立[J] .中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1999,16(4):373.

[4] 韓斌.615小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立[J] .醫(yī)藥論壇雜志,2005,26(23):26-27.