李曉峰 孫偉芬 黃 蘋 劉 玉, 黃偉賢 蘇 齊 陳 強(qiáng) 葉韻斌

細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokine induced killers，CIK）是將人外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞群，因其兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非主要組織相容抗原（MHC）限制性殺瘤特點(diǎn)，從而成為腫瘤過繼免疫治療的重要手段之一[1]。已有研究提示，CIK細(xì)胞的殺傷機(jī)制可能是由NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，即通過CIK細(xì)胞上的活化性受體-NKG2D與腫瘤細(xì)胞上相應(yīng)的配體（NKG2DL）的相互作用，啟動殺傷效應(yīng)[2]。本研究通過在常規(guī)培養(yǎng)體系中加入IL-15誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，并選擇細(xì)胞膜高表達(dá)MHCⅠ鏈相關(guān)分子A （MHC classⅠchain-related gene A，MICA）和不表達(dá)MICA的兩種乳腺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，初步觀察IL-15對CIK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)及體外殺傷活性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株SKBr-3、MDA-MB-231（購自上海細(xì)胞所）本室常規(guī)培養(yǎng)。我們之前研究表明，MDA-MB-231細(xì)胞膜高表達(dá)MICA，而SKBr-3細(xì)胞膜不表達(dá)MICA[3]。

淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，相對密度1.077，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所），D-PBS及人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液KBM-551（日本Takara公司），IL-1α（美國Peprotech公司），IL-2（雙鷺制藥有限公司），IFN-γ（麗珠生物有限公司），IL-15（美國Amoytop Biotech公司），CD3單抗、CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、purified-NKG2D單抗，NKG2D-APC及羊抗鼠IgG1-APC（均美國BD公司）。胰蛋白酶（美國Sigma公司），胎牛血清（Hyclone公司），RPMI-1640、MEM、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），MTT（美國Biomo公司）。

1.2 CIK細(xì)胞的制備

共有15例健康供血者的外周血納入研究，將每例健康供血者的外周血分為2份，分別用于常規(guī)培養(yǎng)組（常規(guī)組）及常規(guī)培養(yǎng)+IL-15組（IL-15組）的培養(yǎng)，每組15份。參照并稍調(diào)整本實(shí)驗(yàn)室建立的CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法[4]，將抗凝外周血用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離，吸取單個核細(xì)胞層，D-PBS洗滌3遍，用人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液KBM-551調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/mL，移至經(jīng)CD3單抗包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入IFN-γ 1000U/mL，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。

1.2.1 常規(guī)組

24h后加入IL-1α 100U/mL、CD3單抗50ng/mL、IL-2 500U/mL，此后每隔3d換液1次，并補(bǔ)加CD3單抗、IL-2。1.2.2 IL-15組

24h后加入IL-1α 100U/mL、CD3單抗50ng/mL、IL-2 500U/mL、IL-15 20ng/mL，此后每隔3d換液1次，并補(bǔ)加CD3單抗、IL-2及IL-15。

1.3 檢測CIK細(xì)胞的NKG2D表達(dá)

取培養(yǎng)第0、7、14、21、28天的CIK細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，分別標(biāo)記一種或多種單克隆抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、NKG2D-APC及相應(yīng)的同亞型對照IgG1，于室溫暗處孵育15min，PBS洗滌去除多余的抗體，上流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。

1.4 封閉CIK細(xì)胞NKG2D受體

取14、21d的常規(guī)組、IL-15組CIK細(xì)胞懸液，10μL purified-NKG2D單抗（終濃度10 μg/mL）封閉5×105個/mL CIK細(xì)胞上NKG2D，冰水浴30min，PBS洗滌兩遍，并用NKG2D-APC標(biāo)記，以流式細(xì)胞術(shù)檢測封閉效果。

1.5 MTT法檢測CIK細(xì)胞的殺傷活性

按效靶比為10∶1，取培養(yǎng)第14、21天的常規(guī)組、IL-15組兩種CIK細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×105（100μL），分別與對數(shù)生長期的MDA-MB-231、SK-Br3細(xì)胞[調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為1×104（100μL）] 混合，加入96孔板中，每組樣品設(shè)3個復(fù)孔；將培養(yǎng)板置飽和濕度為37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)20h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，而后離心，棄上清，每孔再加入100μL的0.04N HCL酸化異丙醇，用滴頭輕輕吹打細(xì)胞，再置于振蕩器上振蕩1min，使黑藍(lán)色結(jié)晶完全溶解。570nm波長測OD值，取3個平行孔平均OD值計算結(jié)果。殺傷活性（%）=[1—（實(shí)驗(yàn)孔OD值—效應(yīng)孔OD值）/靶細(xì)胞孔OD值] ×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫及統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，正態(tài)分布的計量資料作t檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)用Levene檢驗(yàn)。組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細(xì)胞中NKG2D的表達(dá)

2.1.1 NKG2D在T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

表1 NKG2D在T細(xì)胞亞群上的表達(dá) [（±s）%]

*與常規(guī)組比，P＜0.05

+上的表達(dá) 在CD8+上的表達(dá)天數(shù)(d) 常規(guī)組 IL-15組 常規(guī)組 IL-15組培養(yǎng) 在CD4 0 3.05±1.73 3.23±1.16 39.54±5.52 40.32±4.31 7 4.12±1.06 4.94±1.58* 47.19±5.07 52.45±6.96*14 4.75±1.32 6.23±2.14* 57.38±7.75 64.89±10.62*21 5.39±1.98 7.57±1.94* 68.14±7.39 77.57±6.57*28 6.08±1.72 7.83±2.25* 80.25±6.64 88.69±7.35*

NKG2D在CD3CD56雙陽性細(xì)胞上呈高表達(dá)，兩種培養(yǎng)方法中NKG2D表達(dá)率均持續(xù)升高，而IL-15組升高的速率要高于常規(guī)組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同樣的NKG2D表達(dá)升高趨勢見于培養(yǎng)中總的CIK細(xì)胞群上，在培養(yǎng)后的不同時間點(diǎn)檢測IL-15組的NKG2D表達(dá)水平均要高于同期的常規(guī)組的NKG2D表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。提示IL-15可以進(jìn)一步促進(jìn)CC這種NK樣T細(xì)胞及總CIK細(xì)胞群上NKG2D的表達(dá)。

表2 NKG2D在C和總CIK細(xì)胞上的表達(dá) [（±s）%]

*與常規(guī)組比，P＜0.05

+上表達(dá) 在總CIK細(xì)胞上的表達(dá)常規(guī)組 IL-15組 常規(guī)組 IL-15組0 34.42±3.43 35.57±3.22 20.86±6.12 21.53±6.53 7 45.37±4.15 51.76±5.69* 26.95±3.25 32.03±3.14*14 67.82±5.43 78.71±6.14* 40.55±4.23 47.35±5.72*21 80.39±6.61 91.43±4.73* 64.08±5.28 75.23±5.35*28 91.75±2.64 96.31±1.95* 77.97±5.15 89.72±6.24*培養(yǎng)天數(shù)(d) 在CD 3+CD56

2.2 CIK細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性

2.2.1 CIK細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的殺傷活性

當(dāng)效靶比為10∶1時，常規(guī)培養(yǎng)14、21d的CIK細(xì)胞對乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的殺傷活性為（56.33±6.68）%、（62.19±6.75）%，而加入IL-15誘導(dǎo)后的CIK細(xì)胞對MDA-MB-231的殺傷活性為（68.25±7.27）%、（77.33±7.69）%，顯著高于常規(guī)組（P＜0.05）。用抗體封閉了CIK細(xì)胞的NKG2D后，兩組CIK細(xì)胞對該腫瘤細(xì)胞的殺傷活性大幅下降，降幅均在50%左右，但I(xiàn)L-15組的殺傷活性仍高于常規(guī)組，見表3。提示IL-15可以增加CIK細(xì)胞對MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞殺傷活性，CIK細(xì)胞的NKG2D在高表達(dá)NKG2D配體的腫瘤細(xì)胞殺傷中起重要的作用。

表3 CIK細(xì)胞對MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 [（±s）%]

表3 CIK細(xì)胞對MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 [（±s）%]

*與常規(guī)組比，P＜0.05

培養(yǎng)14d 培養(yǎng)21d常規(guī)組 IL-15組 常規(guī)組 IL-15組不封閉 56.33±6.68 68.25±7.27* 65.19±6.75 77.33±7.69*封閉NKG2D 28.73±4.24 32.45±4.08* 33.46±4.31 38.27±4.27*

2.2.2 CIK細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞株SKBr-3的殺傷活性

當(dāng)效靶比為10∶1時，常規(guī)培養(yǎng)14、21d的CIK細(xì)胞對乳腺癌SKBr-3細(xì)胞的殺傷活性為（33.56±5.24）%、（40.78±3.73）%，而加入IL-15誘導(dǎo)后的CIK細(xì)胞對MDA-MB-231的殺傷活性為（39.22±5.29）%、（45.88±5.46）%，顯著高于常規(guī)組（P＜0.05）。封閉了CIK細(xì)胞的NKG2D后，兩組CIK細(xì)胞對該腫瘤細(xì)胞的殺傷活性僅稍微下降，見表4。提示IL-15可以增加CIK細(xì)胞對SKBr-3腫瘤的殺傷活性，而CIK細(xì)胞的NKG2D對低表達(dá)NKG2D配體的SKBr-3細(xì)胞的殺傷影響不大。

表4 CIK細(xì)胞對SKBr-3腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 [（±s）%]

表4 CIK細(xì)胞對SKBr-3腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 [（±s）%]

*與常規(guī)組比，P＜0.05

培養(yǎng)14d 培養(yǎng)21d常規(guī)組 IL-15組 常規(guī)組 IL-15組不封閉 33.56±5.24 39.22±5.29* 40.78±3.73 45.88±5.46*封閉NKG2D 30.68±4.40 34.67±5.12* 37.22±4.15 40.26±3.83*

3 討 論

IL-15是一種功能多樣的細(xì)胞因子，是體內(nèi)外造血前體細(xì)胞向NK細(xì)胞定向發(fā)育的決定性因子，具有促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，上調(diào)NK的細(xì)胞毒活性，促進(jìn)NK細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和趨化作用[5,6]。Roberts等[7]證實(shí)IL-15還可以上調(diào)細(xì)胞毒殺傷淋巴細(xì)胞（CTLs）表面的NKG2D受體表達(dá)并增加NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。我們研究結(jié)果提示：與傳統(tǒng)的CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，加入細(xì)胞因子IL-15誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，能增加主要效應(yīng)細(xì)胞-CD3CD56雙陽性的比例（另文報道），還可以明顯上調(diào)T淋巴細(xì)胞亞群、CC細(xì)胞及總CIK細(xì)胞上NKG2D的表達(dá)。

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