張 軍，周永田，徐旭東，謝 林，李 娟，徐明怡

（1.山東省醫(yī)藥工業(yè)設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013；2.山東省職業(yè)衛(wèi)生和職業(yè)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250002）

近年的研究顯示，許多汞中毒患者出現(xiàn)的長(zhǎng)期、劇烈、自發(fā)性肌肉刺痛或燒灼痛，以下肢為主，常伴有患肢麻木和痛覺過敏，肌電圖顯示神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢[1，2]。目前臨床治療汞中毒主要應(yīng)用螯合劑驅(qū)汞，輔以對(duì)癥治療，對(duì)汞中毒疼痛缺乏有效治療措施。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），由激活的單核-巨噬細(xì)胞分泌，主要合成部位在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的大、中型細(xì)胞[3]。TNF-α廣泛分布于中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)，具有多種生理功能。研究表明，TNF-α與神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生及其持續(xù)狀態(tài)有密切關(guān)系[4]。為探討汞中毒疼痛發(fā)病機(jī)制及有效治療方法，筆者觀察了氯化汞和己酮可可堿對(duì)大鼠脊髓和DRG中TNF-α的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

實(shí)驗(yàn)用HgCl2（上?；瘜W(xué)試劑總廠，生產(chǎn)批號(hào)為990402），二巰丙磺納注射液（DMPS，上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為0309011），己酮可可堿緩釋片（pentoxifylline，POF）（德國 Merckle GmbH 藥業(yè)公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)為C20571）；TNF-α檢測(cè)試劑盒（武漢博生微生物工程有限公司，生產(chǎn)編號(hào)為SA1025）。

1.2 動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，體重180～220 g，（上海希蒲爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK（滬）2003-0002，本院動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度19～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝食飲水。

1.3 分組染汞

將動(dòng)物隨機(jī)分為7組；對(duì)照組（10只）經(jīng)口灌胃生理鹽水（NS）2 mL，1次 /d；A、B、C組（各 5只）按17 mg/kg（1/4LD50）；D、E、F 組（各 5 只）按 8.5 mg/kg（1/8LD50），經(jīng)口灌胃HgCl2溶液，1次/d。7組均連續(xù)灌胃18～22 d。染毒組超過50%的動(dòng)物出現(xiàn)中毒癥狀（動(dòng)物出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，行動(dòng)障礙或痙攣）[5]后停止染汞。疼痛判斷標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物出現(xiàn)抓舔肢體、甩尾、嘶叫、翻身、轉(zhuǎn)圈等表現(xiàn)[6]。

1.4 藥物干預(yù)

50%的動(dòng)物出現(xiàn)中毒癥狀后，處死對(duì)照組5只大鼠和A、D組大鼠，剩余染汞大鼠作藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。B、E組大鼠用DMPS按28 mg/kg腹腔注射驅(qū)汞2個(gè)療程（每天1次，驅(qū)汞3 d，休息4 d為1個(gè)療程），C組大鼠用DMPS+POF（按29.22 mg/kg經(jīng)口灌胃，每天1次，共14 d）；F組和對(duì)照組5只大鼠腹腔注射NS 1 mL/次，方法同DMPS。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死全部動(dòng)物。

1.5 獲取標(biāo)本

用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腔腹注射麻醉動(dòng)物，隨后將其固定于解剖臺(tái)上，剖胸做心臟穿刺，將針頭固定于升主動(dòng)脈，先灌注NS約150 mL，再灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）約200 mL，待動(dòng)物僵硬后取出脊髓L5-6節(jié)段和兩側(cè)L5、L6背根神經(jīng)節(jié)（DRG），置于10%的甲醛磷酸緩沖液中固定，按常規(guī)制成病理切片，片厚15μm。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

用免疫組織化學(xué)鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶聚合物法[7]（SABC）測(cè)定DRG及脊髓TNF-α，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

1.7 圖像分析

用400倍光學(xué)顯微鏡觀察切片，并將圖像通過攝像頭轉(zhuǎn)入計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，用LEICA QWIN V3圖像分析軟件對(duì)病理切片進(jìn)行分析。每個(gè)DRG取5張連續(xù)切片，隨機(jī)選取上、下、左、右、中5個(gè)互不重疊的視野；每個(gè)L5-6脊髓階段連續(xù)取5張切片，在脊髓背角Ⅰ層和Ⅱ?qū)蛹?xì)胞取5個(gè)互不重疊的視野，計(jì)算免疫陽性物的平均灰度和平均面積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS10.0軟件，采用Homogeneity-of-variance首先對(duì)資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊性，單因素方差分析（One-way ANOVA）并采用Dun-nett-test進(jìn)行染毒組與對(duì)照組均數(shù)間兩兩比較；方差不齊時(shí)，用Kruskal-Wallis test非參數(shù)統(tǒng)計(jì)，用Mann-Whitney test進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物染毒與中毒表現(xiàn)

A、B、C（17 mg/kg）組大鼠于染汞第 12 天時(shí)開始出現(xiàn)口腔流涎，口腔出現(xiàn)血性分泌物，精神萎靡，活動(dòng)減少，步態(tài)僵硬、笨拙，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。染汞第19天有9只大鼠出現(xiàn)汞中毒表現(xiàn)，停止染汞。汞中毒大鼠中有1只于染汞第17天出現(xiàn)疼痛表現(xiàn)；該大鼠不停的舔、抓雙下肢、雙后腳和尾部，致使該部位出現(xiàn)紅腫，甚至部分皮膚破損，該大鼠并未受傷，故判斷為汞中毒疼痛。藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)該大鼠仍有疼痛表現(xiàn)。D、E、F（8.5 mg/kg）組大鼠于第16天開始出現(xiàn)口腔流涎，口腔有血性分泌物，活動(dòng)減少，步態(tài)笨拙，精神倦怠，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。于第22天有8只大鼠出現(xiàn)汞中毒表現(xiàn)，停止染汞。無疼痛大鼠出現(xiàn)。對(duì)照組大鼠全部正常生存。

2.2 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積

表1可見，驅(qū)汞前各染汞組大鼠脊髓TNF-a平均灰度均顯著低于對(duì)照組，平均面積均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）；驅(qū)汞 14 d后，B、E、F組 TNF-a表達(dá)仍顯著強(qiáng)于對(duì)照組；C與B組相比，TNF-α灰度顯著提高，平均面積顯著減少（P＜0.05），已接近對(duì)照組水平。

2.3 汞中毒大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積

表2可見，驅(qū)汞前各染汞組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α平均灰度均顯著低于對(duì)照組，平均面積均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）。驅(qū)汞 14 d后，B、E、F組TNF-α平均灰度有所升高，平均面積有所減小，但與對(duì)照組相比，仍有顯著差異。C組與B組相比，TNF-α平均灰度顯著升高，平均面積顯著減少（P＜0.05），已接近對(duì)照組水平。

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積 （n=5，）

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積 （n=5，）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與B組相比，P＜0.05

組別 驅(qū)汞前驅(qū)汞后平均灰度 平均面積 平均灰度 平均面積對(duì)照組 212.93±21.03 3211.56±48.29 267.19±23.57 2917.58±55.81 A組（高Hg） 113.75±4.211） 4937.13±77.031） - -B組（高 Hg+DMPS） 92.56±3.821） 4855.01±82.691） 115.33±18.321） 4407.12±31.451）C組（高Hg+DMPS+己） 99.02±8.211） 5014.05±57.621） 177.63±12.792） 2991.32±29.712）D組（低Hg） 137.53±5.371） 4671.55±77.351） - -E 組（低 Hg+DMPS） 122.65±5.291） 4408.93±47.051） 152.71±11.061） 3851.07±25.991）F 組（低 Hg+NS） 135.66±4.371） 4502.31±54.081） 142.69±11.871） 3908.16±72.191）

表2 汞中毒大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積 （n=20，）

表2 汞中毒大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α平均灰度與陽性反應(yīng)物平均面積 （n=20，）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與B組相比，P＜0.05

驅(qū)汞后平均灰度 平均面積 平均灰度 平均面積對(duì)照組 237.19±7.64 3418.35±67.22 261.27±8.83 3710.47±25.59 A組（高Hg） 116.96±7.261） 5920.48±28.191） - -B組（高 Hg+DMPS） 105.62±7.291） 5671.95±38.271） 131.43±5.771） 4992.73±62.191）C組（高Hg+DMPS+己） 113.28±7.281） 5723.91±62.191） 241.69±7.182） 4012.16±26.972）D組（低Hg） 106.55±4.981） 5594.24±49.381） - -E 組（低 Hg+DMPS） 116.27±7.331） 5829.84±56.381） 144.36±14.311） 4211.06±38.951）F 組（低 Hg+NS） 120.03±6.221） 5891.05±52.181） 142.52±12.071） 3990.35±51.071）組別 驅(qū)汞前

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞急性汞中毒大鼠脊髓后角和背根神經(jīng)節(jié)TNF-α表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而且用DMPS驅(qū)汞14 d后仍未見TNF-α表達(dá)顯著減弱，說明單純用DMPS驅(qū)汞并不能抑制TNF-α 表達(dá)。17 mg/kg染汞（B、C）組和 8.5 mg/kg染汞（E、F）組之間TNF-α平均灰度和平均面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未見到劑量-效應(yīng)關(guān)系，這可能與兩染汞組之間劑量相距較近有關(guān)。

TNF-α是一種前炎性細(xì)胞因子，有多種生物學(xué)效應(yīng)，與神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和持續(xù)存在有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅有單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而且也可以由神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生[8]。當(dāng)機(jī)體處于受傷、感染、免疫功能異常等多種病理狀態(tài)時(shí)，中樞的膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)被激活，釋放出IL-1、IL-6、TNF-α及NGF等多種細(xì)胞因子以及興奮性氨基酸、NO等神經(jīng)遞質(zhì)，它們一方面作用于痛覺神經(jīng)元，使其興奮性增強(qiáng)，向高級(jí)中樞傳遞疼痛信號(hào)，另一方面降低神經(jīng)元的興奮閾值，造成中樞敏化，使許多無效閾下神經(jīng)沖動(dòng)變?yōu)橛行ч撋仙窠?jīng)刺激，使疼痛信號(hào)傳遞的頻率和幅度大為提高。同時(shí)，這些細(xì)胞因子還可以作用于膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生正反饋?zhàn)饔?，進(jìn)一步增加細(xì)胞因子的數(shù)量，形成瀑布效應(yīng)，從而形成了神經(jīng)病理性疼痛的持續(xù)狀態(tài)[9]。

己酮可可堿是黃嘌呤代謝產(chǎn)物，有擴(kuò)張腦和周圍血管的作用，可以改善腦和四肢的血液循環(huán)。近期研究發(fā)現(xiàn)，它還有抑制中樞膠質(zhì)細(xì)胞激活和抑制TNF-α產(chǎn)生的作用[10]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他們的結(jié)論一致，說明己酮可可堿有可能在汞中毒疼痛的治療中，發(fā)揮積極作用。

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