蔣麗娜，程建貞，劉 華，劉雪晴，張曉麗，翟登高，呂占軍

（1.河北北方學(xué)院 免疫教研室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 檢驗(yàn)系示范中心，河北 張家口075000；3.河北北方學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，河北 張家口 075000；4.河北醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動物部）

應(yīng)用免疫生物學(xué)手段治療腫瘤是抗腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。近年來，新城疫病毒（new castle disease virus，NDV）和一些細(xì)胞因子聯(lián)合抗腫瘤作用的研究日益受到重視。白細(xì)胞介素（interleukin 12，IL-12）是由巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的異二聚體細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，不僅對腫瘤有直接的抑制作用，而且能有效激發(fā)和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答，使機(jī)體免疫系統(tǒng)有效發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。本文對小鼠S180實(shí)體瘤模型采用NDV、IL-12、NDV+IL-12進(jìn)行免疫治療研究，通過T細(xì)胞亞群測定、CTL細(xì)胞殺瘤效應(yīng)等研究，從細(xì)胞免疫的角度分析了NDV聯(lián)合IL-12抗腫瘤作用的機(jī)制，為深入研究NDV抗腫瘤作用機(jī)制，以及研制更加有效的抗腫瘤疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 四甲基氮噻唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT）為北京市普京康生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3單克隆抗體、別藻青蛋白（APC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體及鼠重組IL-12試劑購自深圳晶美生物有限公司。

1.1.2 動物 BALB/c小鼠，18～20 g，雌性，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.3 病毒和細(xì)胞株 NDV從中國科學(xué)院病毒所購買，血凝效價(jià)為1：800++，用PBS稀釋病毒至1×1010PFU/mL；S180細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 于BALB/c小鼠左后肢皮下接種2×106個(gè)瘤細(xì)胞，荷瘤成功后，開始抑瘤實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 將40只荷瘤成功的小鼠隨機(jī)分為4組，每組為10只。

生理鹽水（對照組）：荷瘤第7、14及21 d，每只小鼠瘤旁注射生理鹽水0.2 mL。

NDV免疫治療組：荷瘤第7、14及21 d，每只小鼠瘤旁注射NDV 0.2 mL（即2×109PFU/只/次）。

0.5ng/mL IL-12免疫治療組：荷瘤第7、14及21 d每只小鼠瘤旁注射IL-120.2 mL。

NDV+0.5 ng/mL IL-12聯(lián)合免疫治療組：荷瘤第7、14及21天每只小鼠瘤旁注射0.1 mL NDV（即1×109PFU/只/次），同時(shí)在瘤體對側(cè)位右后肢皮下注射0.1 mL IL-12。

1.2.3 抑瘤率和瘤指數(shù)的檢測 末次治療1星期后，各組動物同時(shí)全部處死，剝離瘤體稱重，計(jì)算抑瘤率和瘤指數(shù)。

1.2.4 小鼠脾CTL活性測定 取脾細(xì)胞懸液（2×107/mL）0.25 mL做效應(yīng)細(xì)胞，加入S180靶細(xì)胞懸液（2×106mL）0.05 mL，使效靶比為50︰1。體外培養(yǎng)14 d，用酶標(biāo)儀檢測。

1.2.5 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 收集各組小鼠摘取的眼球抗凝血，采用直接免疫熒光-流式細(xì)胞術(shù)，測定外周血中CD3+T、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分率，并計(jì)算CD4+/CD8+比值，P＜0.05為差異有顯著性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（）表示。多樣本比較采用方差分析，如有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況觀察

自第14日后，生理鹽水組小鼠一般狀況變差，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、毛發(fā)干澀；而同期的NDV組、IL-12組、NDV和IL-12組、小鼠一般狀況明顯優(yōu)于生理鹽水組。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠抑瘤率和瘤指數(shù)的比較

NDV+IL-12組的抑瘤率與NDV、IL-12組相比P＜0.01，NDV組和IL-12組進(jìn)行比較，差異無顯著性（P ＞0.05）（表 1）。

生理鹽水組小鼠瘤指數(shù)為（7.67±0.67），NDV組、IL-12組、NDV+IL-12組的小鼠瘤指數(shù)分別為（5.26±0.49）、（5.51±1.35），（3.95±0.49）、明顯低于生理鹽水組（P＜0.01）；NDV組、IL-12單獨(dú)治療組小鼠與NDV+IL-12組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；NDV組小鼠瘤指數(shù)與IL-12組相比，差異無顯著性，P ＞0.05（表 1）。

表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數(shù)和抑瘤率的變化 （）

表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數(shù)和抑瘤率的變化 （）

注：1）與生理鹽水組相比，P ＜0.01；2）與NDV+IL-12組相比P＜0.01

組別 動物數(shù)（只）體重（g）瘤重（g）抑瘤率（%） 瘤指數(shù)生理鹽水組 10 23.31±1.511.78±0.12 - 7.67±0.67 NDV 組 10 23.63±2.131.24±0.1730.26±9.251）2） 5.26±0.491）2）IL-12 組 10 22.93±1.911.22±0.1331.85±7.241）2） 5.51±1.351）2）NDV+IL-12 組 10 23.24±2.550.91±0.0748.96±3.801） 3.95±0.491）

表2 各組荷瘤小鼠CTL細(xì)胞活性的比較（）

表2 各組荷瘤小鼠CTL細(xì)胞活性的比較（）

注：1）與生理鹽水組相比，P ＜0.01；2）與 NDV+IL-12組相比 P ＜0.01；3）與 IL-12組相比，P＜0.05

組別 動物數(shù)（只） CTL活性生理鹽水組 10 25.05±1.20 NDV 組 10 47.03±3.551）2）3）IL-12 組 10 35.19±3.931）2）NDV+IL-12 組 10 63.84±3.381）

表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率（%）表達(dá)的比較 （%，）

表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細(xì)胞亞群百分率（%）表達(dá)的比較 （%，）

注：1）與生理鹽水組相比，P ＜0.05；2）與 NDV+IL-12組相比，P ＜0.05；3）與 IL-12組相比，P＜0.05

組別CD3 CD4 CD8 CD4/CD8正常對照組生理鹽水組68.00±7.0740.86±4.2045.70±5.5028.68±4.1325.00±2.9711.96±1.021.82±0.182.41±0.42 NDV組IL-12組NDV+IL-12組56.26±2.791） 42.18±2.211） 15.96±1.221）3） 2.65±0.1555.12±6.631）2） 39.65±5.081） 14.53±1.731） 2.73±0.3064.53±9.201） 48.08±8.911） 17.92±1.561） 2.68±0.44

2.3 脾CTL細(xì)胞活性的檢測

從表 2 可以看出，NDV、IL-12、NDV+IL-12 組的CTL細(xì)胞活性與生理鹽水組相比有顯著性差異（P＜0.01）；NDV+IL-12組的CTL細(xì)胞活性比NDV、IL-12組要高（P＜0.01）；IL-12組的CTL細(xì)胞活性低于NDV組（P＜0.05）。

2.4 荷瘤小鼠血液中T細(xì)胞亞群的變化

從表3可見，生理鹽水組荷瘤小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率均低于 NDV、IL-12、NDV+IL-12組。結(jié)果表明，采用NDV、IL-12單獨(dú)治療或NDV+IL-12聯(lián)合治療后，上述指標(biāo)均得到明顯改善（P＜0.05），且 CD4+/CD8+比值也升高。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能，特別是與細(xì)胞免疫功能有著密切的關(guān)系。細(xì)胞免疫在機(jī)體的免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中具有極為重要的作用[2]。提高機(jī)體免疫功能是抗腫瘤作用的一條重要途徑[3，4]。

在本研究中，我們采用NDV、鼠源性IL-12和NDV+IL-12聯(lián)合分組接種，比較觀測了各組對荷瘤小鼠的免疫效果。結(jié)果顯示，NDV、IL-12和NDV+IL-12具有良好的抗腫瘤效果。NDV與IL-12聯(lián)合免疫比單獨(dú)應(yīng)用NDV、IL-12效果更好，腫瘤生長受到明顯抑制，而且CD3+、CD4+細(xì)胞百分率與正常小鼠相當(dāng)，但是CD8+細(xì)胞百分率明顯低于正常小鼠，CD4/CD8比率明顯高于正常小鼠。另外，NDV、IL-12單獨(dú)治療組CD4+、CD8+細(xì)胞百分率及比率方面也顯示類似情況，提示CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤作用可能比CD8+T細(xì)胞更重要。原來認(rèn)為，抗腫瘤細(xì)胞免疫主要是由CTL介導(dǎo)的，但是近年來證實(shí)，CD4+T細(xì)胞在有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答中也起著關(guān)鍵的作用[5]，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也初步說明，CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤作用中具有重要作用。

IL-12是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫極為關(guān)鍵的細(xì)胞因子，即能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，也能刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)CTL細(xì)胞毒活性[6～8]。良好的抗腫瘤狀態(tài)需要Th1細(xì)胞占優(yōu)勢[9，10]，增強(qiáng)Th1細(xì)胞功能，提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力，可成為抗腫瘤免疫治療的手段之一[11～14]。NDV作為活的病毒能很好地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，用NDV+IL-12聯(lián)合免疫小鼠，能人工改善應(yīng)答環(huán)境，有利于CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能是抗瘤效果好于NDV、IL-12單獨(dú)免疫的重要原因。

治療組CD3+T細(xì)胞百分率明顯高于生理鹽水對照組，提示S180肉瘤生長可能有抑制T細(xì)胞活化、增殖及破壞T細(xì)胞的作用，從而降低了小鼠的抗腫瘤作用，其機(jī)制需要深入研究。另外，本研究顯示，NDV組小鼠CTL活性及百分率明顯高于IL-12組，可能NDV的抑瘤作用好于IL-12，但是CD4+T細(xì)胞百分率、抑瘤率和抑瘤指數(shù)并無明顯差別，需要延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)一步觀測。

綜上所述，不論采用NDV、IL-12單獨(dú)治療還是NDV+IL-12聯(lián)合治療，在體內(nèi)都具有一定的的抗腫瘤作用，細(xì)胞免疫方面的指標(biāo)（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）均得到明顯改善，提高了細(xì)胞免疫功能。本研究結(jié)果提示，聯(lián)合免疫效果好于單獨(dú)免疫，其詳細(xì)協(xié)同抗腫瘤作用機(jī)制有待深入研究。

[1]ELENA JLADAS,JUDITHSJACOBSON,DEBORAHD KENNEDY,et al.Antioxidants and cancer therapy:a systematic review[J].Clin Oncol,2004,22(3):517-528.

[2]KUSS I,HATHAWAY B,FERRIS R L,et al.Imbalance in absolute counts of T lymphocyte subsets in patients with head and neck cancer and its relation to disease[J].Adv Otorh Inolaryngol,2005,7(62):161-172.

[3]M JANE EHRKE.Immunomodulation in cancer therapeutics[J].Int Immunophaimacol,2003,3:1105-1109.

[4]THOMAS A WALDMANN.Effective cancer therapy through immunomodulation[J].Annu Rev Med,2006,57:65-81.

[5]KENNEDY R,CELIS E.Multiple roles for CD4+T cell in anti-tumorimmune responses [J].Immunon Rev,2008,222:129-144.

[6]KIKUCHI T,CRYSTAL R G.Anti-tumor immunity induced by in vivo adenovirus vector-mediated expression of CD40 ligand in tumor cells[J].Hum Gene Ther,1999,10(8):1357-1387.

[7]SUN Y,PENG D,LECANDA J,et al.In vivo gene transfer of CD40 ligand into colon cancer cells induces local production of cytokines and chemokines tumor eradication and protective anti-tumor immunity[J].Gene Ther,2000,7(17):1467-1476.

[8]TRINCHIERI G.Immunobiology of interleukin-12[J].Immunon Res,1998,17:269-278.

[9]ROMANI L,MENCACCI A,TONNETTI L,et al.IL-12 is both required and progonostic in vivo for T helper type I differentiation in murine candidiasis[J].J Immunol,1994,152:5167-5175.

[10]PICKER LJ,SINGH MK.Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effector T cells by flow cytometry[J].Blood,1995,86:1408-1419.

[11]PALMER EM,SEVENTRE GA.Human T helper cell differetiation is regulated by the combined action of cytokines and accessory cell dependent costimulatory signals[J].Immnunol,1997,158:2654-2662.

[12]GOEDEGEBUURE PS,DOUVILLE CC.Simultaneous production of T helper-1-like cytokines and cytolytic activity by tumor-specific T cells in ovarian and breast cancer[J].Cell Immunol,1997,175:150-156.

[13]CLAUDE LAMBERT,CHRISTIAN GENIN.CD3 bright lymphocyte population reveal γδT Cells[J].Cytometry Part B(Clinical Cytometry),2004,61B:45-53.

[14]WANG S,ZHENG Z,WENG Y,et al.Angiogenesis and anti-angiogenesis activity of Chinese medical herbal extracts[J].Life Sci,2004,74(20):2467-2478.Chinese