蔡 瑋，張 芳，劉 偉，楊愛軍，王晨昱，李 敏

（蘭州大學基礎醫(yī)學院病理研究所，甘肅 蘭州 730030）

過氧化物酶增殖激活受體-γ（peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ） 是一類核轉錄因子[1]，可以調控腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞增殖。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF/）也與腫瘤細胞的增殖、血管的發(fā)生等方面相關[2]。有研究顯示[3]，轉錄生長因子 -β（transeription growth factor β，TGF-β）是 CTGF上游的調控分子，在腫瘤細胞中，PPAR-γ與TGF-β的表達也相關[4]。本實驗通過體外實驗觀察了PPAR-γ及CTGF對肝癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響及兩者之間的關系。

1 實驗材料

兔抗人多克隆PPAR-γ抗體及兔抗人多克隆CTGF抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。鼠抗人單克隆CTGF抗體（美國Santa Cruz公司）。SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。人肝癌細胞株HepG-2由蘭州大學基礎醫(yī)學院病理研究所提供。甲氮甲唑藍（美國Sigma公司）。鼠尾膠（本實驗室自制）。PPAR-γ激動劑-羅格列酮（rosgilitazone，RGZ）（浙江萬馬公司），完全溶于二甲亞砜，DMSO終濃度不超過0.1%。博依登小室（美國Millipore公司）。

1.1 實驗方法

1.1.1 免疫組化檢測HepG-2細胞中PPAR-γ及CTGF的表達 取對數生長期的HepG-2細胞制成單細胞懸液后爬片。免疫組織化學染色按試劑盒說明操作。制片后光鏡下觀察細胞，細胞漿或細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性表達。

1.1.2 PPAR-γ對HepG-2增殖作用的影響 取對數生長期的HepG-2細胞制成單細胞懸液，調整密度為3×104/mL，懸浮于10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，接種于96孔板，每孔200μL。待細胞帖壁后，吸去原培養(yǎng)基，加入終濃度分別為5、10、20、40和80μmol/L的RGZ，終體積為200μL。每個濃度級設4個復孔，每次設對照組（僅含二甲亞砜的RPMI 1640培養(yǎng)基）。加藥后分別培養(yǎng)12、24、48和72 h，每孔加 MTT溶液 20μL，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清，加二甲基亞砜150μL，振蕩10 min，酶標儀測570 nm波長A值。重復3次試驗，取均值。按以下公式計算，抑制率（inhibition rate，IR%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。增殖率（growth rate，GR%）=（實驗組 A值 /對照組 A值）×100%。

1.1.3 CTGF對HepG-2增殖作用的影響 細胞處理及加樣方法同1.1.2。加入終濃度分別為5、10、20和50μg/mL的CTGF抗體，分別培養(yǎng)24、48、72 h，MTT檢測方法及抑制率、增殖率計算公式同1.1.2。

1.1.4 PPAR-γ及CTGF對HepG-2侵襲性的影響 博依登小室下室加入含40%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，終體積為200μL。將3g/L的自制鼠尾膠按40μL/孔均勻地鋪在博依登小室上下室之間的孔徑為8μm的濾膜的上室面上，置37℃30 min聚合成凝膠。上室加入密度為1.0×106個/mL的HepG-2單細胞懸液（細胞預先在不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h），上室終體積為300μL。將小室置于6孔板內，培養(yǎng)48 h后用棉簽頭擦掉自制鼠尾膠，PBS洗3次，95%乙醇固定。對己穿透的細胞進行蘇木素染色，相差顯微鏡觀察、拍照并計數。每個濾膜分別計數隨機5個視野內的穿膜細胞數后計算平均值。每組設3個平行小室，重復實驗3次。

試驗分為3組；A組：細胞不加處理組。B組：上室細胞預先用RGZ處理48h，濃度為40μmol/L。C組：上室細胞預先用CTGF抗體封閉處理48h，抗體濃度為10μg/mL。

1.1.5 PPAR-γ及CTGF對HepG-2細胞系遷移性的影響 方法兩點不同：膜的上室面不鋪膠；上室細胞濃度為6.0×105個/mL，分組同侵襲實驗。

1.1.6 RT-PCR測定經PPAR-γ激動劑處理后CTGF的表達 設計引物序列如下：CTGF的上游引物5'-GCAGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物 5'-ATGTCTTCATGCTGGTGCAG-3'，產物大小為105 bp；內參β-actin的上游引物5'-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3'，下游引物 5'-GTGCCA CCAGACAGCACTGTGTTG-3'，產物大小為202 bp。Marker由大連寶生物提供，序列號為D513A。RT-PCR引物設計參照有關文獻，經基因庫核實，由上海生物工程公司合成。細胞預先經RGZ處理（濃度為40μmol/L，處理48h），按Trizol試劑盒說明書提取細胞中的總RNA，反應條件為50℃逆轉錄30 min，94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，54℃退火 1 min，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統中拍照記錄、分析結果。

1.2 統計學處理

2 實驗結果

2.1 免疫組化檢測HepG-2中PPAR-γ及CTGF的表達

圖1 HepG-2細胞中PPAR-γ的表達（×200）

圖2 HepG-2細胞中CTGF的表達（×200）

2.2 RGZ對HepG-2作用的時間及劑量依賴性

RGZ對HepG-2細胞增殖有明顯的抑制作用，呈時間和劑量依賴性。與對照組相比，20～80μmol/L的RGZ可以抑制HepG-2細胞的生長，差異有統計學意義（P ＜0.05），而 5μmol/L、10μmol/L的RGZ對細胞生長抑制作用與對照組間差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖 3。

圖3 RGZ對HepG-2作用曲線

2.3 CTGF抗體對HepG-2作用的時間及劑量依賴性

表1 不同濃度CTGF抗體處理后細胞抑制率差異（）

表1 不同濃度CTGF抗體處理后細胞抑制率差異（）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.01

抗體濃度（μg/mL）IR（%）24h 48h 72h對照組 0 0 053.57±0.48 6.12±0.35 2.73±1.8710 13.66±1.072） 16.93±1.382） 11.22±1.85205016.5±0.322）28.02±1.642）20.75±1.792）31.00±1.272）15.37±1.511）27.06±1.242）

經CTGF抗體處理后，HepG-2細胞增殖有明顯的抑制，抗體劑量越大，抑制率越明顯。同一抗體濃度時，48 h抑制率達到最大值。細胞增殖的抑制呈時間和劑量依賴性。10～50μg/mL的CTGF抗體處理后，HepG-2細胞的生長與對照組相比明顯受抑制，差異有統計學意義（P＜0.05），而5μg/mL組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.4 PPAR-γ及CTGF對HepG-2侵襲及遷移能力的影響

可以看出，與RGZ處理前（圖4A）相比，處理后（圖4B）侵襲穿膜細胞數目明顯減少（圖中深染的為蘇木素著色的細胞核）。

侵襲實驗：加入RGZ和CTGF抗體封閉處理后，與對照組相比，侵襲穿膜細胞數目減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 2。

遷移試驗：與對照組相比，PPAR-γ激動劑及CTGF抗體處理之后，遷移穿膜細胞數目都有所減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。PPAR-γ處理組穿膜細胞數變化較CTGF處理組明顯，變化趨勢基本與侵襲試驗一致，見表2。

圖4 RGZ處理前后侵襲穿膜細胞數目的變化（蘇木素染色×100）

表2 RGZ及CTGF抗體處理后HepG-2細胞侵襲及遷移能力的改變（）

表2 RGZ及CTGF抗體處理后HepG-2細胞侵襲及遷移能力的改變（）

注：?與A組比較，P＜0.05

組別 A組 B組 C組侵襲實驗組 67.78±2.13 54.11±3.12? 56.82±4.25?遷移實驗組 89.32±3.57 75.89±5.24? 80.55±3.69?

圖5 RGZ處理前、后CTGF的表達

2.5 經RGZ處理前、后CTGF的表達

表3 RGZ處理前、后CTGF mRNA的表達（）

表3 RGZ處理前、后CTGF mRNA的表達（）

組別 CTGF mRNA未處理組 0.7841±0.0403處理組 0.5783±0.0332

HepG-2細胞中，CTGF有表達，經RGZ處理后CTGF的表達相對于未處理組降低，見圖5，表3。

3 討論

PPAR是核激素受體超家族的成員，它是由英國科學家ISSEMANN和GREEN[5]于1990年首先發(fā)現的。該受體有3種亞型：PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-β-δ，這3種亞型在結構及功能上均有差異[6]。PPAR-γ與配體結合后被激活，其配體包括天然配體和合成配體兩類。天然配體主要有：必需脂肪酸及其代謝產物，如亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸等。人工合成激動劑，如噻唑烷二酮類也就是格列酮類藥物，包括吡格列酮、羅格列酮、曲格列酮、環(huán)格列酮等。

起初對于PPAR-γ的研究主要集中在糖尿病方面，近年來對PPAR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的影響作用的研究也日漸增多，尤其是γ亞型，與腫瘤關系最為密切。研究發(fā)現，PPAR-γ位于機體多種信號傳導的交叉點，其被配體激活后可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，有望成為腫瘤化療的一個新途徑。研究還表明，PPAR-γ活化后抗癌機制主要通過調節(jié)細胞周期[7]、誘導凋亡[3]、抑制COX-2表達[8]等途徑來實現。

本文的研究證實，加入PPAR-γ的激動劑后，HepG-2細胞的生長受到不同程度的抑制，呈劑量及時間依賴關系，且在48 h內，抑制率的改變最具意義，與國外文獻報道一致[9]。進一步通過博依登小室的侵襲和遷移實驗證實，PPAR-γ對細胞侵襲和遷移也同樣發(fā)揮調控作用，加入PPAR-γ激動劑后，肝癌細胞侵襲和遷移能力受到抑制，說明PPAR-γ在肝癌的轉移過程中發(fā)揮著一定的作用，抑制了肝癌細胞的生長、轉移。

CTGF是 CCN家族成員之一，1991年由RADHAM等[10]首先在人類臍靜脈內皮細胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現了人類的CTGF（hCTGF）。目前所發(fā)現的 CCN家族包括 Cry61，CTGF，Nov，W ISP-1，W ISP-2和W ISP-3六個成員。在發(fā)現伊始，對于CTGF的研究主要集中在纖維化方面，各種研究證實，CTGF是纖維化形成過程中的重要介質[4]。

近年來，CTGF與腫瘤的關系也逐漸受到重視。研究發(fā)現，胰腺癌、軟骨肉瘤中CTGF的表達升高[11]，在約61%的急性淋巴細胞白血病患者的骨髓中也出現CTGF的過度表達[12]。CCN是一組功能復雜的基因，它們不僅參與正常機體的生長調控，而且與腫瘤有密切聯系，在腫瘤生長、血管生成、轉移等生物學過程中起重要作用，且功能復雜多樣。CTGF在腫瘤中的具體作用，目前還不是很清楚。

本文在對CTGF的研究過程中發(fā)現，加入CTGF的抗體封閉之后，HepG-2細胞的增殖受到抑制，也呈劑量及時間依賴關系，且肝癌細胞的侵襲及遷移能力也有所下降。CHANG等的研究也有相似的結果[13]。

RT-PCR檢測經 RGZ事先處理（40μmol/L、48h）及未處理組的CTGF的表達的改變發(fā)現，處理組CTGF的表達相對于未處理組下降，提示PPAR-γ參與調控HepG-2的生長，部分是通過改變CTGF的表達來實現的。在肝臟組織中，不僅在纖維化的過程中PPAR-γ-CTGF途徑發(fā)揮重要的作用，在肝癌的發(fā)展過程中，PPARγ-CTGF通路同樣存在并且發(fā)揮調控作用。

PPAR-γ及CTGF都是近幾年才被發(fā)現與癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關的因子，對于其具體的調控機制及作用通路研究并不十分明確，而發(fā)現PPAR-γ-CTGF途徑，無疑為相關的研究和臨床治療提供了一個新的方向。

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