劉秀芬,李一經(jīng)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

豬細(xì)小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。懷孕母豬,特別是初產(chǎn)母豬感染后以流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡為臨床特征。因該病流行面廣、危害嚴(yán)重,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。

PPV屬無(wú)囊膜病毒,衣殼蛋白即是病毒表面的結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP2蛋白在病毒感染發(fā)生,病毒致病性發(fā)揮以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)等方面起著關(guān)鍵作用[1]。Tullis G E等研究表明,缺失VP2蛋白的突變體也喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的再感染性[2]。因此豬細(xì)小病毒VP2蛋白無(wú)論在免疫防治、疾病檢測(cè),還是探討疾病發(fā)生機(jī)理均是重要的結(jié)構(gòu)蛋白。

基于豬細(xì)小病毒VP2蛋白功能特性的重要性,本研究以重組VP2蛋白為免疫原,通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù),制備抗VP2特異性單克隆抗體,并對(duì)單抗和分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行鑒定,為該病及其病原的基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8～10周齡BALB/c小鼠,購(gòu)自黑龍江省醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 免疫原 表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]表達(dá)的VP2蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,切膠純化,PBS稀釋成所需濃度。

1.3 細(xì)胞系 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、ST傳代細(xì)胞,購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心。

1.4 病毒 豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)、豬輪狀病毒(PRV)細(xì)胞培養(yǎng)毒,由本實(shí)驗(yàn)室分離,-20℃凍存。

1.5 主要試劑 完全與不完全弗氏佐劑、PEG3350、IgG抗體亞類試劑盒均購(gòu)自Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 動(dòng)物免疫 8～10周齡BALB/c小鼠進(jìn)行3次腹腔免疫,每次間隔2周,在最后一次免疫3天后取脾臟用于細(xì)胞融合。首免抗原為50 μ g重組PPV VP2蛋白PBS與等量弗氏完全佐劑,第2次加強(qiáng)免疫為相同抗原加弗氏不完全佐劑,第3次加強(qiáng)免疫為相同抗原不加佐劑。

1.7 細(xì)胞融合 以50%PEG3350為融合劑,脾細(xì)胞與SP2/0按8∶1進(jìn)行融合[6]。每孔脾細(xì)胞數(shù)不少于1×105個(gè)。

1.8 單抗篩選 以PPV細(xì)胞培養(yǎng)物作為檢測(cè)抗原,對(duì)融合細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè),鼠抗PPV VP2血清為陽(yáng)性對(duì)照,SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照,P/N值大于2判為陽(yáng)性。陽(yáng)性孔細(xì)胞通過(guò)3～4次克隆篩選后,擴(kuò)大培養(yǎng),凍存。

1.9 腹水單抗制備 將BALB/c小鼠腹腔注入液體石蠟,劑量為0.5 mL/只,7～10 d后腹腔注入雜交瘤細(xì)胞約1×105個(gè)/只,7～15 d后待腹圍明顯增大后用注射器多次收集腹水,低速離心后,收集上清,所得細(xì)胞適當(dāng)稀釋注入另一只小鼠體內(nèi)繼續(xù)生產(chǎn)腹水抗體。間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)。

1.10 染色體數(shù)測(cè)定 將各株雜交瘤細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞分別制備細(xì)胞染色體[5],每個(gè)細(xì)胞取10個(gè)形態(tài)完整、單在,染色體分散良好、無(wú)重疊、無(wú)散失的制片樣本進(jìn)行觀察,計(jì)數(shù),求出平均染色體數(shù)。

1.11 單克隆抗體亞類鑒定 按抗體亞類試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.12 Western blot分析 表達(dá)細(xì)小病毒VP2 pPG-1-VP2-E290/L.casei393誘導(dǎo)后,進(jìn)行 SDSPAGE,半干轉(zhuǎn)印后,各雜交瘤細(xì)胞上清液分別進(jìn)行Western blot抗體檢測(cè)。

1.13 間接免疫熒光法鑒定 接種病毒的ST細(xì)胞,待出現(xiàn)CPE后,倒去培養(yǎng)上清液,刮取細(xì)胞培養(yǎng)物涂片,干燥,冷丙酮固定10 min,0.01 mol/L pH 7.2 PBS洗滌3次,每次3 min,以后分別加雜交瘤細(xì)胞上清液和0.01%伊文思藍(lán)稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃60 min,相同方法洗滌,干燥后,鏡檢觀察[6]。

1.14 單克隆抗體與相關(guān)病毒的反應(yīng)性 PPV、PEDV、TEGV和PRV細(xì)胞培養(yǎng)物為包被抗原,間接ELISA檢測(cè)各株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株建立 經(jīng)過(guò)多次克隆和篩選獲得了5株分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別是2D5、1F11、2B4、3C8和1H3。這5株單抗細(xì)胞上清效價(jià)分別為1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶800、1∶800,腹水抗體效價(jià)分別為1∶106、1∶105、1∶104、1∶104、1∶104,結(jié)果表明,腹水效價(jià)明顯高于上清效價(jià),體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月及凍存后復(fù)蘇均不影響抗體的分泌。說(shuō)明建立的雜交瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體能力。

2.2 染色體數(shù)測(cè)定結(jié)果 染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明,分泌抗體細(xì)胞平均染色體數(shù)目為87～102條,SP2/0骨髓瘤細(xì)胞是56～57條,兩者染色體數(shù)目相差明顯,說(shuō)明篩選的細(xì)胞是屬于雜交瘤細(xì)胞。

2.3 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果 抗體亞類鑒定結(jié)果顯示,2D5分泌抗體為IgG2a型,其余4株1F11、2B4、3C8、1H3均為 IgM 型。

2.4 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

2.4.1 Western blot分析 以雜交瘤細(xì)胞株Western blot檢測(cè),表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行的Western blot分析表明,5株單抗反應(yīng)后均可在約70 kDa出現(xiàn)反應(yīng)帶,大小與預(yù)期結(jié)果相符[7],說(shuō)明所制備的單抗是針對(duì)豬細(xì)小病毒VP2蛋白(見圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)單克隆抗體

圖2 5株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)感染PPV的ST細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光染色結(jié)果

2.4.2 間接免疫熒光鑒定結(jié)果 以PPV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)制備的5株單抗進(jìn)行的間接免疫熒光反應(yīng)結(jié)果表明,2D5、1F11、2B4、3C8 、1H3,感染病毒的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亮綠色熒光反應(yīng),而SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液染色未出現(xiàn)熒光,(見中插彩版圖2),說(shuō)明所制備的單抗能與PPV發(fā)生反應(yīng)。

2.4.3 單克隆抗體與其他相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性間接ELISA結(jié)果表明,5株單抗與PPV反應(yīng)的OD值明顯高于PEDV、TGEV和PRV。從接種病毒和未接種病毒的P/N值結(jié)果看,5株單抗與PPV反應(yīng)的 P/N值均大于 2,而與 PEDV、TGEV和PRV反應(yīng)的P/N值大約在1左右(見表1)。上述結(jié)果說(shuō)明,制備獲得的5株單抗與PEDV、TGEV和PRV不發(fā)生交叉反應(yīng),對(duì)PPV具有較強(qiáng)的特異性。

表1 單抗特異性鑒定結(jié)果

3 討論

單克隆抗體以其均質(zhì)性高、特異性強(qiáng)、易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等特點(diǎn),已成為生物領(lǐng)域基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究的一種重要的工具。本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù),經(jīng)過(guò)多次克隆篩選獲得了抗體效價(jià)高、分泌功能穩(wěn)定的5株雜交瘤細(xì)胞株,通過(guò)Western blot檢測(cè)表明,5株單抗均識(shí)別豬細(xì)小病毒VP2蛋白;間接免疫熒光鑒定和與其他相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性也表明,制備的5株單抗具有與豬細(xì)小病毒高度反應(yīng)的特異性,從而為開發(fā)利用這些單抗,進(jìn)行豬細(xì)小病毒及其疾病的基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究提供了重要的工具。5株單抗是否識(shí)別豬細(xì)小病毒VP2的不同表位以及制備的單抗是否具有中和病毒作用,值得深入探討。

不同抗體亞類出現(xiàn)的時(shí)間與免疫發(fā)生的不同時(shí)期有一定關(guān)系,在免疫發(fā)生的早期,出現(xiàn)的循環(huán)抗體以IgM類為主,隨后出現(xiàn)IgG類。兩類抗體在純化手段,與相應(yīng)抗原的親和力方面存在差別,目前對(duì)IgG類抗體的純化方法相對(duì)成熟,而對(duì)IgM的純化方法、抗體純化效率均不是令人滿意。本次融合篩選獲得的抗體亞類多以IgM 類為主,只有其中1株為IgG類,是否與最后一次加強(qiáng)免疫較早取脾細(xì)胞融合有一定關(guān)系,適當(dāng)推遲融合時(shí)間可能對(duì)提高IgG類的篩選獲得具有幫助。

利用全病毒為免疫原是制備單克隆抗體的常規(guī)方法。本試驗(yàn)采用純化的重組PPV蛋白為免疫原,因刺激抗原成分單一,提高了針對(duì)目的抗原陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株篩選的頻率;避免了以PPV全病毒抗原為免疫原制備單克隆抗體篩選過(guò)程中的大量繁瑣工作和篩選結(jié)果的不確定性,也減少了大量培養(yǎng)和純化病毒的繁瑣過(guò)程和排散病毒的危險(xiǎn)。

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