司興奎,羅汝灶,戴宜發(fā),李彥超,朱麗嫻

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,廣東 佛山528231;2.佛山市南海區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心,廣東佛山528200;3.博羅縣溫氏畜牧有限公司,廣東博羅516157)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,被OIE列為A類(lèi)傳染病,我國(guó)將其列為一類(lèi)傳染病。自1514年FMD首次報(bào)道以來(lái),已蔓延至除北美洲和大洋洲外的世界各地,對(duì)家畜養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在中國(guó),防制豬O型FMD主要采用滅活疫苗免疫與撲殺等綜合性防制措施相結(jié)合的方法,收到了較明顯的效果。但在使用滅活疫苗控制FMD過(guò)程中,由于疫苗質(zhì)量參差不齊免疫效果不理想,接種滅活疫苗副反應(yīng)嚴(yán)重,甚至造成死亡等情況,使研究安全、高效的新型口蹄疫疫苗成為研究熱點(diǎn)。FMD合成肽疫苗作為新型疫苗免疫后抗體水平與油乳滅活疫苗免疫后的抗體水平的差異尚鮮有報(bào)道。鑒于此,本試驗(yàn)擬對(duì)豬O型FMD合成肽疫苗與油乳滅活疫苗免疫后機(jī)體抗體水平進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料 口蹄疫病毒O型抗體阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒PrioCHECKFMD Type O為荷蘭賽迪診斷公司生產(chǎn)(7610420);豬口蹄疫O型合成肽疫苗為中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠生產(chǎn)(0801000,簡(jiǎn)稱(chēng)為D疫苗);豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株)為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)(0802017J,簡(jiǎn)稱(chēng)為A疫苗)。

65頭51日齡健康的大白×長(zhǎng)白×杜洛克×皮特蘭四元雜交豬由博羅縣溫氏畜牧有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) 將65頭51日齡健康四元雜交豬隨機(jī)分為5組(13頭/組),其中1組為健康對(duì)照組,其余4組的疫苗免疫及分組情況見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及疫苗免疫情況

1.2.2 疫苗接種后機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)情況觀察 在每次疫苗接種后 24、48、72 h及 96 h后,檢測(cè)直腸溫度、觀察飼料攝入情況、記錄應(yīng)激性倒地及嘔吐等疫苗接種后的副反應(yīng)。

1.2.3 免疫抗體水平的阻斷ELISA檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)略作修改進(jìn)行。具體步驟為:首先將參考血清1～4及待檢血清樣品以ELISA緩沖液按1∶10進(jìn)行稀釋,每孔加入100 μ L室溫感作1 h,傾除孔內(nèi)液體,洗板4次后拍干;每孔加入100 μ L酶標(biāo)結(jié)合物溶液,室溫感作1 h,傾除孔內(nèi)液體后,洗板4次后拍干;每孔加入 100 μ L底物溶液,避光室溫孵育15 min;每孔加入100 μ L終止液后,OD450 nm判讀,記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,以阻斷率不低于50%判定為陽(yáng)性。

1.2.4 數(shù)據(jù)表示和分析方法 疫苗免疫各組抗體阻斷率的均值(以表示)。采用t檢驗(yàn)對(duì)不同時(shí)相疫苗免疫各組進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗接種后機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)情況 在每次疫苗接種后 24、48、72 h及 96 h后,對(duì)直腸溫度、減料、記錄應(yīng)激性倒地及嘔吐等疫苗接種后的副反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),合成肽疫苗注射后副反應(yīng)輕微,僅表現(xiàn)為減料和輕度發(fā)熱的情況,而嘔吐、應(yīng)激性倒地等情況均未出現(xiàn);同比下,油乳滅活疫苗接種后存在一定程度的副反應(yīng),特別在首免后48 h內(nèi)減料、發(fā)熱均較為嚴(yán)重,個(gè)別豬有嘔吐、應(yīng)激性倒地等情況;在二免后的48 h內(nèi)雖然也有一定程度的副反應(yīng),但從群體的反應(yīng)程度上已減弱;在三免時(shí),各組接種疫苗的副反應(yīng)基本可以忽略。

2.2 免疫抗體水平的檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)試劑盒提供的判定方法,參考血清1～4均符合確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn),在此基礎(chǔ)上計(jì)算出各血清樣品的阻斷率,健康對(duì)照組的抗體阻斷率在首免后 2周,阻斷率均值均低于50%,判定為陰性。試驗(yàn)各組的抗體阻斷率結(jié)果見(jiàn)表3及圖1。從圖1及表3可見(jiàn),DD組及DDD組的抗體水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致,即在首免后2周至4周之間,抗體水平并未呈現(xiàn)上升趨勢(shì),推測(cè)與母源抗體水平影響有關(guān)(除DDD組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)外);在二免后抗體水平不斷攀升,并在首免后6周達(dá)到峰值并維持至試驗(yàn)結(jié)束,3次免疫組在抗體水平達(dá)到峰值后較二次免疫組在維持峰值過(guò)程中波動(dòng)相對(duì)較小。AA組的抗體水平變化趨勢(shì)為在首免后2周和4周之間抗體水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在4WPI后抗體水平逐步攀升,在8WPI達(dá)到峰值,隨后抗體水平逐步下降;AAA組的抗體變化趨勢(shì)為在首免后2周至 6周內(nèi),抗體水平持續(xù)下降,在6WPI后逐步攀升,在12WPI前后達(dá)到峰值,直至試驗(yàn)結(jié)束。

從免疫效果的次序上看,DDD組免疫效果最好,其抗體水平在 4WPI后迅速上升且顯著高于AAA組,在6WPI達(dá)到峰值,但在 10WPI后迅速下降,從組間不同時(shí)相抗體水平比較看:在6～10WPI間,DDD組抗體水平極顯著高于AA組和AAA組(DDD組抗體水平在10WPI還顯著高于DD組),在4WPI之后DDD組抗體的阻斷率一直高于50%;DD組免疫效果位居第二,其抗體水平在4WPI后上升在6WPI達(dá)到峰值后略有下降,但在8WPI后略有回升,當(dāng)升至與6WPI峰值處保持穩(wěn)定,組間不同時(shí)相抗體水平比較結(jié)果表明,在4、6、10WPI及12WPI DDD組抗體水平顯著高于AAA組(在 6WPI極顯著高于 AAA 組),在 6WPI及12WPI DDD組抗體水平還極顯著高于AA組;AA組免疫效果位居第3,其抗體水平在8WPI達(dá)到峰值,抗體有效期維持7～10WPI之間,組間不同時(shí)相的比較結(jié)果顯示AA組抗體水平在4WPI及6WPI顯著高于AAA組;AAA組免疫效果最差,在10WPI接近保護(hù)值,且維持較平穩(wěn)的狀態(tài),直至試驗(yàn)結(jié)束。

表2 疫苗接種后機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)情況

表3 免疫后各組血清樣品的抗體阻斷率(%)

3 討論

口蹄疫是一種偶蹄動(dòng)物烈性、高度傳染性疾病,給世界畜牧業(yè)造成很大損失。目前,我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)普遍使用的是豬口蹄疫油乳滅活疫苗。但豬口蹄疫O型油乳滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中由于需要加入滅活劑,且存在較高比例的異體蛋白,因此在對(duì)生豬免疫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)高熱不退、食欲廢絕、呼吸困難、流涎、伴有嘔吐、全身發(fā)紺、站立不穩(wěn)等異常情況,如不能及時(shí)救治部分生豬甚至死亡[1]。本試驗(yàn)中豬口蹄疫O型油乳滅活疫苗接種后副反應(yīng)情況,進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。鑒于此,選擇一種能替代或部分替代傳統(tǒng)豬口蹄疫O型油乳滅活疫苗的新型疫苗在生產(chǎn)實(shí)際中具有非常重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。合成肽疫苗是以合成的一段免疫原性肽抗原配以適當(dāng)?shù)妮d體或/和佐劑制成的疫苗。相對(duì)于傳統(tǒng)的弱毒苗和滅活苗以及其他幾種新型的疫苗,肽類(lèi)疫苗具有以下特點(diǎn):合成肽疫苗是一種純粹抗原性疫苗具有安全、無(wú)毒、穩(wěn)定及副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn);由于其分子結(jié)構(gòu)小而簡(jiǎn)單,很少會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥及醫(yī)源性感染問(wèn)題;第三是可精確定位,合成T、B細(xì)胞抗原表位并能可進(jìn)行不同組合,有望制成針對(duì)多種病原的超級(jí)疫苗[2]。豬口蹄疫O型合成肽疫苗正是基于上述理念研制成功,其主要含有口蹄疫O型病毒VP1 B細(xì)胞表位(VP1環(huán))和T細(xì)胞表位的7種寡肽,將這些寡肽和鑰孔鏚血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián),然后混合于弗氏完全佐劑中,制備成合成肽疫苗,能夠產(chǎn)生足夠的抗體,保護(hù)牛和豬不發(fā)病[3]。本試驗(yàn)中針對(duì)豬口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后的副反應(yīng)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)除接種豬除短時(shí)間的發(fā)熱及減料外,并無(wú)常規(guī)口蹄疫疫苗接種后的高熱不退、食欲廢絕、呼吸困難、流涎、伴有嘔吐、全身發(fā)紺、站立不穩(wěn)等情況也證實(shí)了合成肽疫苗安全、穩(wěn)定及副反應(yīng)小等特點(diǎn)[1]。

通過(guò)豬口蹄疫O型合成肽疫苗與油乳滅活疫苗的比較,不難看出豬口蹄疫O型合成肽疫苗不但可誘導(dǎo)較油乳滅活疫苗更高水平的特異性抗體,并抗體維持時(shí)間較長(zhǎng);且豬口蹄疫O型合成肽疫苗3次免疫組在抗體水平達(dá)到峰值后較二次免疫組在維持峰值過(guò)程中波動(dòng)相對(duì)較小,在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)于預(yù)防豬口蹄疫O型將具有更加積極的作用。

[1]朱玉華,陳亮.生豬注射口蹄疫滅活苗引起免疫應(yīng)激的防治[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(18):223.

[2]魚(yú)艷榮,張彥明,劉希成.多肽疫苗抗病毒作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,23(6):480-482.

[3]王世若,王興龍,韓文瑜.現(xiàn)代動(dòng)物免疫學(xué)[M].長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1996:320-321.