張一昕 楊牧祥 于文濤 李保義 崔永昌 高瑋

肝纖維化的特征是肝細胞增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)聚集，并需轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)參與，CTGF是 TGF-β1的下游效應(yīng)介質(zhì)，具有介導(dǎo)TGF-β1促細胞外基質(zhì)沉積的作用，阻斷CTGF可抑制TGF-β介導(dǎo)的 ECM產(chǎn)生［1］。柔肝消癥飲是根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床觀察篩選的治療肝硬化的效方，既往藥效學(xué)實驗已證實柔肝消癥飲具有顯著的保護肝功能、抗肝硬化作用［2，3］。為了探討其作用機制，課題組觀察了柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝組織CTGF表達變化的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，動物合格證號:SCXK(鄂)2004-007。

1.2 藥物 柔肝消癥飲組成:由香附、青皮、炙黃芪、炒白術(shù)、白芍、三棱、莪術(shù)、地鱉蟲、郁金、姜黃、丹參等藥物組成，水煎濃縮成所需濃度的藥液。復(fù)方鱉甲軟肝片:由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批號國藥準(zhǔn)字Z19991011，實驗時用蒸餾水配制成所需濃度的藥液。

1.3 主要試劑 CTGF抗體購自武漢博士德生物工程有限公司)，3%H2O2液、0.01M枸櫞酸緩沖液、二抗工作液、鏈酶素卵白素、DAB顯色劑等均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器 LEICA RM2125型切片機、VANOXAHB-L型OLYMPUS萬能顯微鏡、Nikon顯微照相機、HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 模型制備 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為造模組48只和正常組12只。參照相應(yīng)文獻［3，4］48只造模組大鼠首次予皮下注射40%CCL4花生油溶液0.5 ml/100 g體重，以后每周2次皮下注射0.3 ml/100 g體重，共9周。造模開始前2周均以20% 豬油、0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心加工)喂養(yǎng)，第3～9周以0.5%膽固醇和99.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心加工)喂養(yǎng)。整個造模期間以30%乙醇作為飲料讓大鼠自由飲用。正常組則以正常飼料和純凈水喂養(yǎng)。實驗9周末確認造模成功后予以分組治療。

2.2 分組與治療 造模結(jié)束后，正常組隨機抽取大鼠10只，將造模成功大鼠隨機抽取40只，并分為4組，每組10只，雌雄各半。即:①正常對照組(簡稱正常組):灌服生理鹽水;②模型組:灌服生理鹽水;③柔肝消癥高劑量組(簡稱高劑量組):每日用藥劑量為2.5 g/100 g體重;④柔肝消癥低劑量組(簡稱低劑量組):每日用藥劑量為1.25 g/100 g體重;⑤復(fù)方鱉甲軟肝片對照組(簡稱對照組):每日用藥劑量為0.056 g/100 g體重。各治療組均將藥物配制成所需濃度，1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 ml/100 g計算，共4周。

2.3 動物取材 治療4周末，于最后一次給藥后禁食12 h麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血后切開腹部，迅速剖取肝臟，取少許肝組織，用4%多聚甲醛固定。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取用4%多聚甲醛固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4.2 肝組織CTGF表達的免疫組化觀察 CTGF的免疫組化法依照SABC試劑盒操作步驟進行。免疫組化染色結(jié)果判定:經(jīng)DAB顯色后，細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物者為CTGF免疫陽性。反應(yīng)產(chǎn)物顏色淺、顆粒稀疏者為陽性信號弱;反應(yīng)產(chǎn)物顏色深、顆粒密集者為陽性信號強。用Nikon顯微照相系統(tǒng)對肝組織切片進行觀察、照相，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng)，在100×視野下每張切片取8個視野，測定平均灰度值作半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列規(guī)則成索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布。肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，無異常改變。肝細胞呈多邊形，胞漿均勻，細胞核形態(tài)正常。模型組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，間質(zhì)內(nèi)彌漫性淋巴細胞浸潤。肝細胞體積明顯增大，局部肝細胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，可見到再生的肝細胞(雙核)。肝間質(zhì)廣泛纖維組織增生，將正常肝小葉分割成大小不等的肝細胞團(即假小葉形成)。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)輕度受損，少數(shù)肝細胞氣泡樣變性，較少炎性細胞浸潤，偶見壞死細胞，少量纖維組織增生，但未見形成間隔。低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，部分肝細胞氣泡樣變性并伴有細胞壞死，較多淋巴、單核細胞浸潤，纖維組織增生，但較少形成間隔。對照組與低劑量組基本相似。

3.2 柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝組織CTGF表達的影響

免疫組織化學(xué)染色可見:正常組大鼠肝組織CTGF有少量表達，而模型組大鼠肝組織陽性細胞的表達則呈彌散性分布，黃染顆粒主要位于細胞漿中。各用藥組大鼠肝組織陽性細胞的表達則呈散在性分布，且分布明顯少于模型組，而高、低劑量組大鼠肝組織陽性細胞的表達少于對照組。

半定量分析顯示:模型組大鼠肝組織CTGF表達的光密度值明顯高于正常組(P＜0.01)。經(jīng)用藥干預(yù)后，各用藥組大鼠肝組織CTGF表達的光密度值均低于模型組(P＜0.01)。其中，高、低劑量組低于對照組(P＜0.01);高劑量組低于低劑量組(P＜0.05)。結(jié)果詳見表1。

4 討論

肝硬化在古代醫(yī)籍中無此病名及相關(guān)的描述，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等病證范疇。中醫(yī)學(xué)認為本病多由酒食不節(jié)，損傷脾胃，脾失健運，壅阻氣機，肝失條達，氣血郁滯，或情志抑郁，肝失疏泄，氣郁日久，血流不暢，瘀血停積，脅絡(luò)痹阻所致。其病位在肝脾兩臟，主要病機為肝郁脾虛、氣滯血瘀。故當(dāng)以疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消癥為主要治法。課題組經(jīng)多年臨床觀察，精心篩選相關(guān)藥物組成“柔肝消癥飲”。方中香附、青皮疏肝理氣;炙黃芪、炒白術(shù)健脾益氣;三棱、莪術(shù)、土鱉蟲、丹參、郁金、姜黃，破血行氣，逐瘀消癥;白芍養(yǎng)血柔肝，既可助香附、青皮疏肝解郁之力，又可防止破血太過之弊;諸藥合用，共奏疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消癥之功效。

表1 各組大鼠肝組織CTGF的表達情況(±s)

表1 各組大鼠肝組織CTGF的表達情況(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.01;與對照組比較:△P＜0.01;與高劑量組比較:▲P＜0.05

表達的光密度值正常組 6 0.109±0.017組別 例數(shù) CTGF*模型組 6 0.444±0.033高劑量組 6 0.161±0.024＊△低劑量組 6 0.212±0.018＊▲對照組 6 0.243±0.281*

CTGF是一種C端富含半胱氨酸的分泌多肽，屬即刻早期基因CCN家族，是一重要的促組織纖維化蛋白，具有有絲分裂原效應(yīng)，促進血管平滑肌等細胞增殖;在其他細胞因子的協(xié)同作用下刺激細胞外基質(zhì)的合成，抑制其降解，導(dǎo)致ECM的聚集及結(jié)構(gòu)改建，表達細胞粘附分子。TGFβ1是導(dǎo)致組織纖維化形成的最重要的細胞因子之一，CTGF為其下游效應(yīng)介質(zhì)，TGF-β1作用于CTGF的啟動子區(qū)域刺激CTGF的合成分泌，CTGF則通過直接作用于星形膠質(zhì)細胞和結(jié)締組織刺激細胞外基質(zhì)的分泌介導(dǎo) TGF-β1致纖維化的作用［5］。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織CTGF的表達明顯高于正常組，經(jīng)藥物治療后的肝硬化大鼠肝組織內(nèi)纖維組織減少，CTGF表達也隨之減少，顯示該方劑治療肝硬化化可能與降低CTGF表達，抑制HSC活化增殖轉(zhuǎn)化為成纖維細胞和肌成纖維樣細胞，特異性地阻斷TGF-β致纖維化的負面效應(yīng)有關(guān)，這可能是其治療肝硬化的作用機制之一。

［1］QiW，Chen X，Twigg S，et al.Tranilast attenuates connective tissue growth factor-induced extracellularmatrix accumulation in renal cells.Kidney Int，2006，69(6):989.

［2］楊牧祥，張一昕，王少賢，等.柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝功能的影響.中醫(yī)藥通報，2007，6(3):58-59.

［3］楊牧祥，張一昕，王少賢，等.柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)和肝細胞超微結(jié)構(gòu)的影響.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18(1):38-42.

［4］Shi B，Yang Z，Zhang L，et al.The association of expression CTGF in cirrhotic liver tissue and procogene c-fos，c-mand child-pugh grade.Chin J Surg，2001，39(6):466-468.

［5］Sun K，Wang Q，Huang XH.PPAR gamma inhibits growth of rathepatic stellate cells andTGF beta-induced connective tissue growth factor expression.Acta PharmacolSin，2006，27(6):715.