冉旭華,聞曉波,王 密,李冬野,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319)

豬戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)*

冉旭華,聞曉波*,王 密,李冬野,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319)

利用分子生物學(xué)軟件分析GenBank公布的豬戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,確定了其C端抗原性較高的區(qū)域,針對(duì)此區(qū)域設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物,RT-PCR擴(kuò)增該區(qū)域,并將此片段克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)上,命名為pET30a-ORF2C,然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明,RT-PCR擴(kuò)增得到301 bp的片段,重組蛋白大小約為18 ku,與預(yù)期大小相符。Western blot分析表明,該蛋白與陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),為進(jìn)一步利用其建立診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

豬戊型肝炎病毒;ORF2;主要抗原表位區(qū);表達(dá)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的、經(jīng)消化道傳播的急性病毒性肝炎,其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、食欲不振、惡心、嘔吐、尿色深黃、常見(jiàn)黃疸,病程可持續(xù)1周,但具有自限性[1]。該病主要發(fā)生于衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國(guó)家。HEV可在多種動(dòng)物體內(nèi)分離到,1997年美國(guó)發(fā)現(xiàn)了豬戊型肝炎病毒,且與人HEV具有較高的同源性,隨后證實(shí)其為一種人畜共患病病原,因其具有重要的公共衛(wèi)生意義而備受重視[2]。

豬戊型肝炎病毒(Swine hepatitis E virus,SHEV)屬杯狀病毒科,為無(wú)囊膜的單股正鏈 RNA病毒,直徑 27 nm～32 nm,表面粗糙,呈不規(guī)則球形?；蚪M全長(zhǎng)約為7.2 kb～7.6 kb,5′端有27 bp的非編碼區(qū),基因組編碼3個(gè)開(kāi)放閱讀框架ORF1、ORF2和 ORF3[3]。ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)RNA依賴(lài)性RNA聚合酶;ORF2編碼病毒的衣殼蛋白,富含重要的抗原表位;ORF3編碼磷蛋白,可能為型特異性抗原表位,與特異性免疫反應(yīng)有關(guān)。SHEV目前尚不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),所以其診斷與檢測(cè)多使用重組抗原或合成肽抗原,相關(guān)研究多是圍繞ORF2和ORF3開(kāi)展的,尤其是其結(jié)構(gòu)蛋白ORF2[4]。

本試驗(yàn)從大慶地區(qū)采集的糞便病料中用特異性引物擴(kuò)增得到SHEV ORF2 C端的主要抗原表位區(qū),使用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá),為利用此重組蛋白作為診斷抗原建立檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、陽(yáng)性血清和載體 病料采自大慶地區(qū)的1月齡～3月齡仔豬糞便;陽(yáng)性血清、pMD18-T載體、pET30a(+)載體、大腸埃希菌 TG1、BL21由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存供用;BL21(DE3)pLysS購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 酶和試劑 ExTaqDNA聚合酶、BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker(DL 2 000)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;鼠源反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自MBI Fermentas;RNA酶抑制劑、Trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;HRP購(gòu)自Jackson公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的SHEV DQ1株序列(DQ279091)[5]設(shè)計(jì)ORF2 C端主要抗原表位區(qū)的特異性引物,委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下(酶切位點(diǎn)下劃線):

Upper:5′-AAGGATCCGGCGAGCCGACTGTGAAACTT T-3′(BamH Ⅰ)

Lower:5′-GCGAAGCTTCGGTAGCCACGTTAACAAATGTCAC-3′(Hind Ⅲ)

1.2.2 病毒基因組RNA的提取 糞便用滅菌PBS制成100 mL/L懸液,10 000 r/min離心15 min取上清,置-20℃?zhèn)溆?。按照T rizol RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組RNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 取RNA,參照 MBI Fermentas的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取上述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系如下:10×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNT P 4 μ L,引物 1 μ L(上下游引物各0.5 μ L),cDNA 1 μ L,ExTaqDNA 聚合酶 2 U,補(bǔ)水至50 μ L。反應(yīng)條件為95℃變性5 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 回收上述PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TG1感受態(tài)細(xì)胞,堿裂解法提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切鑒定,篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。目的片段酶切后連接到pET30a(+)載體上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞,陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET30a-ORF2C。

1.2.5 重組蛋白表達(dá) 對(duì)重組菌的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)中采用最佳的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。陽(yáng)性菌于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8,用終濃度 1.0 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h,而后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blot 經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(0.22 μ m)上,50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜,1∶50倍稀釋的SHEV陽(yáng)性血清室溫孵育1 h,PBST洗滌。1∶500倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG室溫孵育1 h,PBST洗滌,DAB顯色,進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增出1條301 bp的特異性片段,與預(yù)期相符(圖1),測(cè)序結(jié)果表明為SHEV ORF2 C端序列。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

用1.0 mmol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)5 h。SDSPAGE電泳檢測(cè),結(jié)果表明目的蛋白得到了高效表達(dá),重組蛋白分子質(zhì)量約為18 ku(圖2)。

2.3 Western blot分析

表達(dá)的重組蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,可與SHEV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),顯色后出現(xiàn)單一且特異的清晰條帶(圖3)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product

圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analy sis of the expressed proteins

3 討論

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的人畜共患病,呈世界性分布,既有散發(fā)也有流行,但主要分布在衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國(guó)家,在亞洲等發(fā)展中國(guó)家存在的主要是基因Ⅳ型。最近幾年從豬體內(nèi)也檢測(cè)到了戊型肝炎病毒,并證實(shí)豬戊型肝炎具有重要的公共衛(wèi)生意義。我國(guó)有關(guān)SHEV的研究才剛剛開(kāi)展,流行病學(xué)調(diào)查表明,在多個(gè)省市及地區(qū)普遍存在,感染率較高,以基因Ⅳ型為主。

圖3 Western blot分析Fig.3 Western blot analy sis

SHEV病毒對(duì)體外環(huán)境敏感,抵抗力弱,且目前還沒(méi)有成熟的體外培養(yǎng)系統(tǒng),這使其診斷和疫苗的研發(fā)較為困難。目前該病毒的檢測(cè)方法主要有ELISA、RT-PCR、血清中和試驗(yàn)、免疫印跡、免疫電鏡、免疫熒光等。各種方法各由利弊,ELISA法因其可用于大規(guī)模的臨床檢測(cè)而被廣泛應(yīng)用。而由于該病毒培養(yǎng)困難,所以其包被抗原主要采用合成抗原。

SHEV基因組編碼的3個(gè)ORF中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,抗原性較弱,不適合作為診斷抗原。而ORF2和ORF3編碼的蛋白具有較好的抗原活性,是研制SHEV ELISA診斷試劑的主要分子靶標(biāo)[6]。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道利用不同的表達(dá)系統(tǒng)(大腸埃希菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、桿狀病毒和酵母)研究不同區(qū)域的免疫原性,用于制備SHEV診斷試劑[7]。研究結(jié)果表明,表達(dá)抗原對(duì)SHEV抗體的敏感性和特異性的次序依次為:含有ORF2和ORF3表達(dá)抗原的重組蛋白＞ORF2表達(dá)抗原＞ORF3表達(dá)抗原[8]。ORF2編碼的衣殼蛋白抗原表位數(shù)量較多,特別是其富含疏水區(qū)的C端2/3部分,存在多個(gè)能誘導(dǎo)免疫保護(hù)的免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位,是人工制備SHEV診斷抗原的首選區(qū)域。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)SHEV進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,證實(shí)黑龍江省大慶地區(qū)有SHEV,且以基因Ⅳ型為主[9],并針對(duì)大慶分離的SHEV進(jìn)行了抗原表位的初步探索與研究[10-11]。本研究在此國(guó)內(nèi)外研究背景下,通過(guò)使用DNA Star軟件分析已公布的SHEV大慶分離株DQ1株的ORF2氨基酸序列,針對(duì)其C端抗原性高的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)RT-PCR從糞便中擴(kuò)增得到目的片段,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-ORF2C,經(jīng)誘導(dǎo)在大腸埃希菌中高效表達(dá)。純化后的蛋白經(jīng)Western blot鑒定具有良好的生物活性。本研究為下一步利用該重組蛋白作為診斷抗原對(duì)大慶地區(qū)SHEV進(jìn)行檢測(cè)奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為該病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的篩選提供依據(jù)。

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Expression of C-terminal Major Epitope Domain of ORF2 of SHEV inE.coli

RAN Xu-hua,WEN Xiao-bo,WANG Mi,LI Dong-ye,HOU Xi-lin

(Provincial K ey Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultral University,Daqing,Heilongjiang,163319,China)

To express C-terminal major epitope domain of ORF2 of swine hepatitis E virus(SHEV)inE.coli,C-terminal major epitope domain in ORF2 was primarily mapped upon analysis of Bioinformatic software,according to the amino acid sequence of SHEV DQ1 strain in GenBank.A pair of specific primers were designed to amplify the fragment encoding the major epitope domain.This fragment was cloned into the multiple cloning site of pET30a(+)vector after subjecting to restriction endonuclease digestion.The recombinant plasmid was designated as pET30a-ORF2C,and was transformed intoE.coliBL21 competent cells.Expression of recombinant protein was induced by addition of final concentration of 1.0 mmol/L IPTG under 37℃condition.Results showed that the length of RT-PCR product of interest is 301 base pairs,the size of recombinant protein is 18 ku.The result of Western blot showed that the recombinant protein specifically reacted with serum against SHEV,suggesting the recombinant protein had wonderful specificity,and can be used as antigen in diagnostic assay for measuring antibodies against SHEV in clinical practice.

Swine hepatitis E virus;ORF2;major epitope domain;expression

Q786;S852.659.6

A

1007-5038(2010)01-0024-04

2009-08-21

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(11521201)

冉旭華(1978-),女,黑龍江人,副教授,博士,主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究。*通訊作者