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        尼卡巴嗪混懸液的研制及其對(duì)雞球蟲病的療效*

        2010-05-31 08:37:22劉小艷方炳虎楊利軍袁照紅
        關(guān)鍵詞:卡巴艾美耳盲腸

        劉小艷,方炳虎,邱 電,朱 鑫,楊利軍,袁照紅

        (1.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

        尼卡巴嗪混懸液的研制及其對(duì)雞球蟲病的療效*

        劉小艷1,方炳虎2*,邱 電1,朱 鑫1,楊利軍1,袁照紅1

        (1.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

        以尼卡巴嗪為原料,純化水為溶媒,利用膠體磨采用分散法成功研制出尼卡巴嗪混懸液,并對(duì)制劑進(jìn)行了穩(wěn)定性研究。所有參試樣品的外觀性狀、沉降體積比、再分散性、相對(duì)含量等指標(biāo)均無明顯變化,表明該制劑穩(wěn)定性良好。試驗(yàn)了尼卡巴嗪混懸液對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效。結(jié)果表明,對(duì)經(jīng)口一次人工感染1.0×105個(gè)/只柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊的雛雞按100 kg飲水中分別添加100 g/L尼卡巴嗪混懸液25、50、100 mL的劑量混飲連續(xù)給藥5 d,其保護(hù)率均達(dá)100%,抗球蟲指數(shù)分別為189.7、189.9、184.2,屬高效抗球蟲藥。

        尼卡巴嗪;混懸液;研制;柔嫩艾美耳球蟲;藥效

        雞球蟲病是目前危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要疾病之一,是由艾美耳屬球蟲感染所致,臨床表現(xiàn)為血痢、貧血等癥狀,發(fā)病率和死亡率可達(dá)80%以上,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于球蟲疫苗的研究與實(shí)際應(yīng)用尚存在不少問題有待解決,目前防治球蟲病仍以藥物為主。尼卡巴嗪為4,4′-二硝基均二苯脲(C13H10N4O5)和2-羥基-4,6-二甲基嘧啶(C6H8N2O)的復(fù)合物,為黃色或黃綠色粉末,不溶于水[2]。尼卡巴嗪對(duì)雞的多種艾美耳球蟲病,均有良好防治效果,其主要抑制第二個(gè)無性增殖期裂殖體的生長繁殖,其作用峰期是感染后第4天,球蟲對(duì)本品不易產(chǎn)生耐藥性,對(duì)其他抗球蟲藥耐藥的球蟲使用本品仍有效[2]。尼卡巴嗪因其自身的良好特點(diǎn)以及價(jià)格上的優(yōu)勢(shì),國內(nèi)外一直廣為應(yīng)用,在日本尼卡巴嗪使用量約占抗球蟲劑的50%左右?,F(xiàn)應(yīng)用的劑型為預(yù)混劑,劑型單一。尼卡巴嗪混懸液是將難溶于水的尼卡巴嗪,分散在水介質(zhì)中,并輔以助懸劑、潤濕劑等所形成的不均勻分散系的供內(nèi)服的混懸液體制劑。尼卡巴嗪研制成混懸液以后可以供水飲用,操作靈活,可減少勞動(dòng)強(qiáng)度,特別是在雞感染球蟲后減料或是不吃料,飲水給藥是較好的途徑,臨床療效試驗(yàn)表明,本制劑可顯著提高臨床應(yīng)用效果。本試驗(yàn)采用分散法研制尼卡巴嗪混懸液并進(jìn)行臨床試驗(yàn),為了客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)尼卡巴嗪混懸液對(duì)雞球蟲病的治療效果,根據(jù)農(nóng)業(yè)部《實(shí)驗(yàn)臨床實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》(試行)要求進(jìn)行了人工誘發(fā)雞柔嫩艾美耳球蟲病的藥效研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 藥品和試劑 尼卡巴嗪原料為浙江升華拜克生物股份有限公司生產(chǎn),檢驗(yàn)合格;尼卡巴嗪對(duì)照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(批號(hào)為H0331005),C13H10N4O5含量為 99.0%,C6H8N2O含量為99.9%;250 g/kg尼卡巴嗪預(yù)混劑為廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司動(dòng)物保健品廠生產(chǎn);羧甲基纖維素鈉為湖州展望藥業(yè)有限公司生產(chǎn);甘油為江蘇淮安淮陰醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn);純化水自制;其他所用試劑均為分析純。

        1.1.2 主要儀器 德國賽多利斯CP225D-電子天平;溫州七星乳品設(shè)備廠JM-LB80型膠體磨島津UV-2450PC紫外可見分光光度計(jì),LHH-150GSP型綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱。

        1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物、飼料以及供試卵囊 從廣東某大型孵化場購買1日齡新興黃5號(hào)雞苗,飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境中,14日齡時(shí)鏡檢糞便中無球蟲卵囊后分組進(jìn)行試驗(yàn);訂購的飼料不含任何抗球蟲藥,飲用潔凈的自來水;臨床分離純種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲病教研室保存,用前復(fù)壯。

        1.2 方法

        1.2.1 尼卡巴嗪混懸液的制備 采用分散法[3-6]研制尼卡巴嗪混懸液。以純化水為溶媒,添加合適的助懸劑、濕潤劑、抗氧化劑、防腐劑等,利用膠體磨充分研磨配制成成品,并考察其外觀性狀、沉降體積比、易再分散性、pH、含量等項(xiàng)目,選擇各指標(biāo)最佳者進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)研究。

        1.2.2 尼卡巴嗪混懸液中尼卡巴嗪的含量檢測(cè)方法

        1.2.2.1 測(cè)定波長的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法進(jìn)行。

        取本品(供試樣品)適量(約相當(dāng)于尼卡巴嗪0.1 g),置 100 mL容量瓶中,加二甲基甲酰胺80 mL,置超聲波中超聲15 min,冷卻,用二甲基甲酰胺稀釋至刻度,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液5 mL,置500 mL量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻。精密量取10 mL,置25 mL容量瓶中,精密加10 mL/L乙醇制氫氧化鉀溶液5 mL,用乙醇稀釋至刻度,搖勻。用分光光度法測(cè)定,5 min內(nèi)在360 nm~560 nm波長范圍之間掃描,記錄吸收曲線。另取尼卡巴嗪對(duì)照品、按生產(chǎn)處方配制的不含主藥的空白對(duì)照樣品,同法測(cè)定,并記錄吸收曲線。

        1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:取105℃干燥至恒重的尼卡巴嗪對(duì)照品0.1 g,置100 mL量瓶中,用二甲基甲酰胺溶解并定容至刻度,即成1.0 mg/mL的尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用乙醇稀釋成2、6、10、14、18、22、26 μ g/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取10 mL,置25 mL容量瓶中,精密加入10 mL/L乙醇制氫氧化鉀溶液5 mL,用乙醇稀釋至刻度,搖勻。用分光光度法測(cè)定,在5 min內(nèi)讀取被測(cè)溶液在430 nm波長處的吸收度。

        1.2.3 尼卡巴嗪混懸液穩(wěn)定性試驗(yàn)方法 依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2005年版一部附錄中《獸藥穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》進(jìn)行加速試驗(yàn)[9]。供試品適量,棕色藥用玻璃瓶密封包裝,放置于 LHH-150GSP型綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(溫度30℃±2 ℃,相對(duì)濕度60%±5%)6個(gè)月。于第1、2、3、6個(gè)月末分別取樣一次,對(duì)樣品的性狀、沉降體積比、再分散性、含量等進(jìn)行檢測(cè)。

        1.2.4 尼卡巴嗪混懸液對(duì)人工誘發(fā)雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效試驗(yàn)

        1.2.4.1 分組與處理 將14日齡試驗(yàn)雛雞逐只稱重后,選擇個(gè)體體重差異小的健康雞,隨機(jī)分成6組,其中中劑量的藥物試驗(yàn)組為250只,其余各組50只[10]。第1、2組分別為不給藥不攻蟲對(duì)照組(即陰性對(duì)照組)和感染不給藥對(duì)照組(即陽性對(duì)照組);第3、4、5組分別為試驗(yàn)藥物由高到低劑量組,藥物濃度為每100 kg水中添加100 g/L尼卡巴嗪混懸液分別為100、50、25 mL,感染后第 3天開始給藥,連續(xù)飲水給藥5 d;第6組為藥物對(duì)照組,按每噸飼料添加250 g/kg尼卡巴嗪預(yù)混劑400 g拌料應(yīng)用,感染后第3天開始,連續(xù)拌料給藥5 d[2]。

        1.2.4.2 攻蟲與記錄 除陰性對(duì)照組(即第1組)外,各試驗(yàn)組每只雛雞在分組當(dāng)天嗉囊灌服柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1.0×105個(gè)。試驗(yàn)期間,每天觀察記錄雞的精神、飲食欲、血便情況和死亡數(shù)等。感染后第5、6、7天早晨對(duì)各組進(jìn)行血便記分。第8天各組分別逐只稱重后剖殺全部雞,觀察盲腸病變,并進(jìn)行盲腸內(nèi)卵囊計(jì)數(shù)。

        1.2.4.3 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)

        (1)癥狀觀察。每天觀察、記錄雞群的飲食欲、精神狀態(tài)。

        (2)增重情況。于試驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)分別測(cè)稱每組中每只雞的體重,并由此算出平均增重和相對(duì)增重率[11-13]。相對(duì)增重率=(試驗(yàn)組增重率/不感染不用藥對(duì)照組增重率)×100%。

        (3)糞便檢查。每天觀察、記錄糞便的變化情況,并作血便記分。具體標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行:0分為無血便;1分為血便比例少于25%;2分為25%~50%的糞便帶血;3分為50%~75%的糞便帶血;4分為多于75%的糞便帶血。

        (4)死亡情況。記錄雞死亡數(shù),剖檢觀察確定死因,由此計(jì)算出存活率。

        存活率=(試驗(yàn)組雞總數(shù)-試驗(yàn)期間因球蟲感染死亡雞數(shù)量)/試驗(yàn)組雞總數(shù)×100%。

        (5)盲腸病變記分。參照病變記分法進(jìn)行病變記分,并將病變記分換成病變值[11-12,14]。病變值=病變記分×10。于感染后第8天宰殺全部雞,剖檢觀察盲腸病變(兩側(cè)盲腸病變不一致時(shí)以嚴(yán)重一側(cè)為準(zhǔn)),按4分制進(jìn)行病變記分。

        0分為無肉眼可見病變;1分為盲腸壁有少量散在出血點(diǎn)或出血斑,腸壁不增厚,有正常腸內(nèi)容物;2分為出血點(diǎn)或出血斑數(shù)量增多,腸內(nèi)容物明顯帶血,腸壁略增厚,有正常腸內(nèi)容物;3分為盲腸腔內(nèi)有大量血液或出現(xiàn)盲腸芯(血凝塊或灰白色干酪樣香蕉型塊狀物),盲腸壁極度增厚,盲腸腔沒有或僅有少量的盲腸糞便;4分為因出血量多和干酪樣盲腸芯大,盲腸極度擴(kuò)張,盲腸腔內(nèi)沒有糞便或糞便已被包在腸芯中。剖檢證實(shí)為球蟲死亡雞,記為4分。

        (6)卵囊值。刮取盲腸內(nèi)容物用100 g/L次氯酸鈉消化15 min后,用血球記數(shù)并換算出每對(duì)盲腸中的卵囊數(shù)值[11-12,15]。每對(duì)盲腸中卵囊數(shù)值和卵囊值之間的換算關(guān)系見表1。

        表1 卵囊數(shù)和卵囊值的轉(zhuǎn)換Table 1 The conversion of oocyst number and oocy st value

        (7)耗料情況。記錄各組耗料量和總增重,由此算出料肉比。

        (8)抗球蟲指數(shù)??骨蛳x指數(shù)(anticoccidial index,ACI)[11-12]:按照美國默克(Merck)公司的計(jì)算公式,即ACI=(相對(duì)增重率+存活率)×100-(病變值+卵囊值)

        藥物效果判定標(biāo)準(zhǔn):抗球蟲指數(shù)>180者為高效;160~180者為中效;<160者為低效;<120者為無效。

        2 結(jié)果

        2.1 尼卡巴嗪混懸液的研制

        經(jīng)過大量的處方篩選及穩(wěn)定性試驗(yàn),以羧甲基纖維素鈉作為助懸劑,甘油作濕潤劑,并添加適量的抗氧化劑等,以純化水為分散媒介利用膠體磨采用分散法制備100 g/L的尼卡巴嗪混懸液,制得的成品穩(wěn)定、均勻細(xì)膩、再分散性良好。

        2.2 尼卡巴嗪混懸液中尼卡巴嗪的含量檢測(cè)

        2.2.1 檢測(cè)波長的確立 按照分光光度法測(cè)定,在360 nm~560 nm波長范圍之間掃描記錄色譜圖。

        結(jié)果表明,按生產(chǎn)處方配制的不含主藥的空白對(duì)照樣品經(jīng)與供試樣品、對(duì)照品同樣處理后在360 nm~560 nm波長范圍掃描空白對(duì)照樣品幾乎無吸收,供試樣品、對(duì)照樣品在430 nm波長處有最大吸收峰,并結(jié)合參考文獻(xiàn)資料,選定430 nm波長作為尼卡巴嗪的測(cè)定波長(圖1)。

        2.2.2 尼卡巴嗪含量測(cè)定的線性范圍及回歸方程

        制備的尼卡巴嗪幾個(gè)不同濃度梯度測(cè)定結(jié)果表明,以吸光度作為縱坐標(biāo)(y),以濃度(x)為橫坐標(biāo),得回歸方程:y=0.087x+0.009,r=0.999 9,在0.8 μ g/mL ~10.4 μ g/mL 范圍內(nèi) ,吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

        圖1 尼卡巴嗪吸收曲線Fig.1 Absorption spectrum curve of nicarbazine

        2.3 尼卡巴嗪混懸液的穩(wěn)定性

        加速試驗(yàn)結(jié)果表明,制得的100 g/L尼卡巴嗪混懸液顏色與顆粒等性狀、沉降體積比、再分散性、相對(duì)標(biāo)示含量等各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著變化。制劑的性狀、顆粒、顏色、再懸性、沉降體積比等指標(biāo)未見變化,表明混懸穩(wěn)定性良好[16]。以上表明本制劑在棕色藥用玻璃瓶密封包裝下比較穩(wěn)定。

        2.4 對(duì)人工誘發(fā)雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效試驗(yàn)

        2.4.1 癥狀觀察 攻蟲感染后第4天,不給藥對(duì)照組出現(xiàn)少量血便,雞發(fā)病明顯,表現(xiàn)精神沉郁,食欲減退,但沒有雞死亡。第5天開始時(shí),攻蟲不給藥組血糞嚴(yán)重,試驗(yàn)雞開始死亡;第6天時(shí)血便逐漸減少,未見死亡。攻蟲不給藥組共死亡14只雞,剖檢死雞見盲腸明顯腫大,內(nèi)有大量血液。

        對(duì)照藥物尼卡巴嗪預(yù)混劑組沒有出現(xiàn)死亡,但部分雞精神狀態(tài)差及飲食減少,有少量血糞。尼卡巴嗪混懸液低劑量組有若干雞精神狀態(tài)差及飲食減少,未出現(xiàn)血糞和雞死亡。尼卡巴嗪混懸液中、高劑量組采食和飲水正常,精神狀態(tài)良好。

        2.4.2 藥物療效評(píng)價(jià) 結(jié)果表明,尼卡巴嗪混懸液中劑量治療組未出現(xiàn)血便、存活率為100%,相對(duì)增重率為 97.9%。盲腸未見卵囊,其抗球蟲指數(shù)(ACI)達(dá)189.9,明顯優(yōu)于對(duì)照的尼卡巴嗪預(yù)混劑組。尼卡巴嗪混懸液高劑量100 mg/L組的抗球蟲效果與50 mg/L劑量組效果差異不顯著(表2)。

        表2 幾組藥物抗Eimeria tenella的效果Table 2 The efficacy of several groups of anticoccidial drugs against Eimeria tenella

        從結(jié)果來看,尼卡巴嗪混懸液除低劑量組于感染后第5天出現(xiàn)少量的血便外,其中中劑量組和高劑量組均未出現(xiàn)血便,表明藥物的使用對(duì)死亡、增重、病變及卵囊產(chǎn)生都有顯著的改善。

        3 討論

        3.1 關(guān)于制劑的研制

        影響藥物混懸性能的主要因素是藥物粒徑的大小和分散介質(zhì)的性能,在混懸劑中添加適量的助懸劑,使藥物容易分散和減緩顆粒沉降[17]。藥物粒徑越小,分散介質(zhì)的黏度越大,藥物沉降越緩慢[18]。本制劑中的助懸劑采用羧甲基纖維素鈉為輔料,利用膠體磨研磨采用分散法制得的產(chǎn)品均勻細(xì)膩、沉降緩慢穩(wěn)定好、易再分散,還有利于延緩藥物的釋放。

        3.2 關(guān)于制劑中尼卡巴嗪的測(cè)定

        本文建立了以選定430 nm波長作為尼卡巴嗪的分光光度法測(cè)定波長。在測(cè)定時(shí),因尼卡巴嗪混懸液長期放置后,顆粒沉降,溶液即分層,故稱量前必須充分搖勻,且溶液黏稠不便于直接量取,應(yīng)經(jīng)過測(cè)定相對(duì)密度后進(jìn)行換算。

        3.3 關(guān)于對(duì)人工誘發(fā)雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效試驗(yàn)

        本試驗(yàn)中感染不給藥組有28%的試驗(yàn)雞因感染球蟲死亡,試驗(yàn)期的相對(duì)增重率僅為75.3%。盲腸病變值為3.55,卵囊值為20,ACI為91.8。說明本試驗(yàn)攻蟲劑量合適,適宜用做抗球蟲藥物的效果評(píng)價(jià)[19]。

        本次試驗(yàn)結(jié)果表明,尼卡巴嗪混懸液的高、中、低劑量組的抗球蟲指數(shù)均超過184以上,顯示具有良好的抗球蟲效果,其效果優(yōu)于對(duì)照藥物尼卡巴嗪預(yù)混劑(抗球蟲指數(shù)為183.2),同時(shí)表明雞在感染球蟲后采食量下降,飲水給藥是較好的途徑。就各單項(xiàng)指標(biāo)而言,各藥物組都有輕微病變出現(xiàn),但病變值均明顯低于不給藥對(duì)照組,平均增重和相對(duì)增重率也明顯提高。除低劑量組盲腸檢出少量卵囊,其他用藥組的盲腸中均沒有檢出卵囊。

        結(jié)果表明,尼卡巴嗪混懸液按50 mg/L~100 mg/L(以尼卡巴嗪計(jì)算)飲水給藥適宜用于臨床雞球蟲病的治療。

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        Study on Preparation of Nicarbazine Suspension and Its Efficacy onEimeria tenella

        LIU Xiao-yan1,FANG Bing-hu2,QIU Dian1,ZHU Xin1,YANG Li-jun1,YUAN Zhao-hong1

        (1.Guandong Dahuahong Animal Health Products Co.,L td,Xinxing,Guangdong,527400,China;2.College of Veterinary Medcine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

        Nicarbazine suspension was developed successfully by using colloidmill to suspend the nicarbazine in purified water.The nicarbazine concent of preparation samples was determined by spectrophotometry.The preparation was carried on a stability experiment.At the end of the test,all programs,such as color,the ratio of settling volume,redispersibility,content,had no significant changes.The experimental results indicated that the suspension was stable.The anticoccidial efficacy of 100 g/L nicarbazine suspension was studied in chicks artificially infected withEimeria tenellaof 1.0×105orally per chick.Results demonstrated that 100 g/L nicarbazine suspension administrated at 25,50 and 100 mL/100 kg water in chicks for 5 days provided excellent protection againstE.tenella,with protective rate of 100%.The experiment indicated that nicarbazine suspension is a highly effective anticoccidal drug.Anticoccidal indexes of the drug at 25,50 and 100 mL/100 kg water were 189.7,189.9 and 184.2,respectively.

        nicarbazine;suspension;preparation;Eimeria tenella;efficacy

        S852.723;S859.79

        A

        1007-5038(2010)02-0065-05

        2009-06-25

        劉小艷(1975-),女,湖南衡陽人,碩士,主要從事獸藥制劑與添加劑產(chǎn)品開發(fā)研究。*通訊作者

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