甄洪花,沈志強,單 虎,王金良

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

豬IL-2和IL-6的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備*

甄洪花1,沈志強2*,單 虎1,王金良2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

IL-2和IL-6是機體重要的免疫調(diào)節(jié)因子,在佐劑的應(yīng)用方面具有很好的發(fā)展前景。論文以pTIL-2和pTIL-6為模板進(jìn)行PCR擴增得到豬白細(xì)胞介素2(pIL-2)和豬白細(xì)胞介素6(pIL-6)的全基因序列,通過EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切及連接反應(yīng)將目的基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET30a中構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒pETIL-2和pET IL-6。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)和 Rosetta(DE3),37℃在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)了pIL-2和pIL-6,分子質(zhì)量分別約為26 ku和30 ku。將包涵體純化并復(fù)性后免疫家兔,制備的兔抗pIL-2和pIL-6的多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測效價在1∶12 800以上。

豬白細(xì)胞介素2;豬白細(xì)胞介素6;原核表達(dá);多克隆抗體

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激后轉(zhuǎn)錄表達(dá)和分泌的一類小分子多肽或糖蛋白的生物活性物質(zhì),是機體內(nèi)重要的細(xì)胞因子之一。其在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞,對免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用。白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素6(IL-6)是機體重要的免疫調(diào)節(jié)因子,具有多種生物學(xué)活性。IL-2屬于Thl細(xì)胞因子,能刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞生長增殖,激活T細(xì)胞分泌 IFN,增強CTL、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,誘導(dǎo)HK、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性和抗感染活性,主要發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。IL-6屬于Th2細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化并產(chǎn)生抗體,主要作用于成熟的B細(xì)胞,產(chǎn)生免疫球蛋白IgM 、IgG、IgA,主要發(fā)揮體液免疫功能,也可以促進(jìn)PHA或刀豆球蛋白A激活的T細(xì)胞增殖生長。兩者在免疫應(yīng)答系統(tǒng)中相輔相成,在分別刺激細(xì)胞與體液免疫的同時也能相互誘導(dǎo)對方而開啟另一支路[1-3],IL-2與IL-6的這種協(xié)同作用有可能成為一種能夠平衡Thl和Th2應(yīng)答的新型、高效的免疫增強劑。但天然動物機體內(nèi)細(xì)胞因子含量低,且機體組織與體液成分錯綜復(fù)雜,分離純化過程繁瑣費時。已有研究證明,豬IL-2和IL-6基因在大腸埃希菌中表達(dá)出的融合蛋白具有一定生物活性[4-6],且同一種物種的白細(xì)胞介素具有極高的保守性[7],本試驗采用基因工程方法構(gòu)建了豬IL-2和IL-6的原核表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)進(jìn)行了表達(dá),其后提取包涵體,純化復(fù)性后免疫家兔制備了兔抗豬IL-2、IL-6的多克隆抗體,為進(jìn)一步研究這兩種細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及今后的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

各種限制酶及T4 DNA連接酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、UNIT-10柱式DNA膠回收試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;葡萄球菌A蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司;DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;受體菌E.coliDH5α及表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)和Rosetta(DE3)、表達(dá)載體pET30a均為山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院實驗室保存;pTIL-2和pT IL-6為山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院王金良研究員構(gòu)建保存。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)pTIL-2和pTIL-6的基因序列,用Primer 5.0軟件設(shè)計合成了特異性引物 P21 和 P22,P61 和 P62,P21:5′-CTGGAATTCGACGATTCAATGTATAAGAT -3′(EcoRⅠ),P2 2:5′-AGTAAGCTTCCCGGGGATCCTCT -3′(HindⅢ);P61:5′-CGGGAATTCGCTATGAACTCC CTC-3′(EcoRⅠ);P62:5′-TAGAAGCTTGTGCCCCAGC-TACATTAT-3′(HindⅢ),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 豬IL-2、IL-6基因的PCR擴增、克隆及序列測定 以含有IL-2和IL-6基因的質(zhì)粒pT IL-2和pTIL-6為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系(50 μ L)如下 :10 ×PCR buffer 5 μ L,引 物 (10 μ mol/L)各2 μ L,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μ L,rTaqDNA 聚合酶1 μ L。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃40 s,56℃35 s,72℃40 s,35個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。將目的基因與pMD18T載體連接后(分別命名為pMDIL-2和pMDIL-6)送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用EcoRⅠ和HindⅢ同時分別雙酶切 pMDIL-2、pMDIL-6和pET30a,然后回收目的片段和載體片段,用T4連接酶連接進(jìn)行定向克隆,構(gòu)建原核表達(dá)載體pETIL-2和pETIL-6,PCR和酶切方法進(jìn)行鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒pETIL-2和pETIL-6的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pETIL-2、pETIL-6轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,挑選單菌落接種于1 mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,取過夜培養(yǎng)物以1∶50～1∶100的比例接入新的含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液中,37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600=0.4～0.6),加 IPTG(終濃度為 1 mmol/L)誘導(dǎo)2 h～6 h,離心收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE和Western bolt分析鑒定目的蛋白的表達(dá)情況(以誘導(dǎo)前的菌體為對照)。

1.2.5 重組蛋白包涵體的提取、純化 將大量誘導(dǎo)的表達(dá)菌(150 mL)離心收集菌體,用10 mmol/L TE緩沖液(pH 8.0)洗菌體一次,除去殘留培養(yǎng)基成分,再用10 mmol/L TE緩沖液(pH 8.0,內(nèi)含200 μ g/mL溶菌酶)重懸菌體,置37℃溫浴1 h后,加DT T與T riton X-100至終濃度分別達(dá)5 mmol/L與10 mL/L。然后進(jìn)行高頻短時超聲波處理數(shù)次。再4℃,12 000 r/min離心10 min后,分別收集上清與沉淀進(jìn)行120 g/L的SDS-PAGE電泳,鑒定重組蛋白是可溶形式還是以包涵體形式存在。依據(jù)SDS-PAGE結(jié)果,將重組包涵體溶解于8 mol/L的尿素中,裝入透析袋中4℃進(jìn)行梯度透析復(fù)性,再用PEG20000濃縮透析液,用Bradford染料結(jié)合法測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度至 0.5 mg/mL～1 mg/mL,過濾除菌后備用。

1.2.6 兔抗豬IL-2、IL-6多克隆抗體的制備 將上述純化的蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合,充分乳化,于家兔頸部、背部多點皮下注射,劑量為1 mg免疫原/只,間隔15 d,再將純化蛋白與等量弗氏不完全佐劑相混,充分乳化進(jìn)行加強免疫,之后每周加強免疫一次。每周采血用ELISA方法檢測抗體效價,抗體水平達(dá)到要求后頸動脈采血收集血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 豬IL-2、IL-6基因的PCR擴增結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察,可見約524 bp和669 bp大小的清晰條帶,與預(yù)期片段大小相符(圖1),連接T載體后測序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對,結(jié)果相符。

圖1 IL-2和IL-6基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of IL-2 and IL-6

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pETIL-2、pETIL-6的鑒定

分別以陽性重組子pETIL-2和pETIL-6為模板進(jìn)行PCR鑒定,用10 g/mL的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物,擴增片段大小與預(yù)期相符(圖2)。重組子pETIL-2、pETIL-6分別用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,分別可得到5 422 bp和524 bp、5 422 bp和669 bp的片段(圖3),結(jié)果與預(yù)期大小相符,表明目的片段已插入pET30a中。

2.3 重組質(zhì)粒 pETIL-2、pETIL-6表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western-blot鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)中均大量表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果顯示,pETIL-2、pETIL-6分別在26 ku和30 ku處有一條特異蛋白帶(圖4),與預(yù)期大小相符,而對照無此條帶。經(jīng)凝膠薄層掃描,IL-2在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)中的表達(dá)量分別為14.5%和27.4%,IL-6在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)中的表達(dá)量分別為59.7%和49.5%。Western blot鑒定結(jié)果顯示所表達(dá)的兩種蛋白均可以與鼠源的抗HIS標(biāo)簽的抗體發(fā)生反應(yīng)(圖5),表明所表達(dá)的蛋白具有良好 的反應(yīng)原性。

圖2 重組質(zhì)粒pETIL-2和pETIL-6的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR products of pETIL-2 and pET IL-6

圖3 重組質(zhì)粒pETIL-2和pETIL-6的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasmid pETIL-2 and pETIL-6 by enzyme digestion

圖4 pETIL-2和pETIL-6表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analy sis of expressed products of pETIL-2 and pETIL-6

圖5 pETIL-2和pETIL-6表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定結(jié)果Fig.5 Western-bolt analysis of expressed products of pETIL-2 and pETIL-6

2.4 重組蛋白包涵體的提取與純化

pIL-2與pIL-6在大腸埃希菌表達(dá)體系中得到大量表達(dá),以致形成不可溶的包涵體形式,純化后目的蛋白的含量可達(dá)90%以上。復(fù)性、濃縮后測定蛋白濃度可達(dá)1.2 mg/mL。

2.5 兔抗豬IL-2、IL-6多克隆抗體的制備

以純化復(fù)性后的IL-2和IL-6蛋白稀釋1 000倍后作為包被抗原,間接ELISA法測定IL-2和IL-6的抗體效價。結(jié)果表明二免一周后的效價可達(dá)1∶6 400,三免后的效價可達(dá) 1∶12 800以上,而未免疫的家兔對照組抗體均為陰性,說明所表達(dá)的IL-2和IL-6蛋白具有良好的免疫原性,能夠使家兔產(chǎn)生高效價的多克隆抗體。

3 討論

養(yǎng)豬業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著相當(dāng)重要的地位,但是豬的一些烈性傳染病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前在我國疫苗的使用仍是豬病防控的主要途徑,而佐劑直接關(guān)系到疫苗的使用效果。豬IL-2和IL-6是高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有調(diào)節(jié)機體免疫功能,增強機體免疫力的作用,作為佐劑使用可以有效提高疫苗的免疫保護(hù)力。田國寶等[8]研究表明,豬IL-2、IL-4分子佐劑能顯著提高口蹄疫疫苗的抗體水平及保護(hù)率。Yang Y等[9]將豬的IL-2基因亞克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒VR1020中,用殼聚糖納米顆粒包裹后肌肉注射已免疫豬副傷寒菌疫苗的小鼠,35 d后給小鼠口服沙門菌,發(fā)現(xiàn)小鼠的IgG、IgA 、IgM 、IL-2、IL-4 、IL-6、特異性抗體的含量及免疫活性細(xì)胞的數(shù)量均比對照組有明顯增加。蘇丹等[10]將改組的豬IL-2基因與重組CpG質(zhì)粒經(jīng)離子交聯(lián)法制備的殼聚糖納米顆粒包裹后肌肉注射已接種豬偽狂犬病滅活疫苗的免疫豬,結(jié)果豬對偽狂犬病滅活疫苗的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平顯著增加。Zheng L H等[11]將IL-6基因與CpG基序作為偽狂犬弱毒疫苗佐劑免疫剛出生的小豬,其后檢測其特異性抗體、淋巴細(xì)胞活性及誘導(dǎo)的IL-2的活力等各項指標(biāo)發(fā)現(xiàn)小豬的免疫應(yīng)答能力顯著提高。Wu M等[12]將豬IL-6基因與CpG序列亞克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒上,與豬瘟-巴氏桿菌-豬丹毒三價苗共同免疫小鼠,結(jié)果顯示小鼠的白細(xì)胞、單核細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量及特異性抗體的含量均顯著增加。陳建林等[13]將包裹有豬IL-4、IL-6的融合基因和CpG基序的殼聚糖納米顆粒肌肉注射接種過豬藍(lán)耳病滅活苗的長白川白雜交豬,接種后發(fā)現(xiàn)血清中 IL-2、IL-4、IL-6和 IgG 、IgA 、IgM 及特異抗體的含量較對照組均顯著增多,淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量也明顯升高。上述研究表明豬白細(xì)胞介素作為佐劑具有很大的應(yīng)用價值,且選取不同的白細(xì)胞介素進(jìn)行組合使用可能會有更好的效果。本研究選用的豬IL-2和IL-6分屬于 Th1型和 Th2型細(xì)胞因子,將它們進(jìn)行組合使用有可能成為一種新型、高效的免疫佐劑。

利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲取目的蛋白是基因工程技術(shù)中常用的方法,相對于真核表達(dá)其制備過程簡單,目的蛋白產(chǎn)量大。本研究選用PET30a質(zhì)粒采用基因工程方法構(gòu)建了大腸埃希菌表達(dá)質(zhì)粒PET IL-2和pETIL-6對豬IL-2和IL-6的全基因序列進(jìn)行表達(dá),在BL21(DE3)和 Rosetta(DE3)兩種宿主菌中都得到了表達(dá),嚴(yán)琳等[14]曾用PET28b載體表達(dá)含有IL-6信號肽的全基因序列結(jié)果未獲得表達(dá),而去掉信號肽后則獲得了高效表達(dá),分析可能與信號肽序列中的疏水氨基酸有關(guān),與本試驗的結(jié)果并不相符,但信號肽疏水性氨基酸的存在是否影響其表達(dá)量還有待于進(jìn)一步證實。IL-2的表達(dá)量較低,分析可能與IL-2有明顯的疏水區(qū)域有關(guān),真核基因在原核生物中的表達(dá)存在密碼子偏愛性的問題也可能是原因之一,可以嘗試更換不同的載體進(jìn)行試驗。

PET30a為高效原核表達(dá)載體,表達(dá)的融合蛋白含有6個組氨酸配體。配體相對分子質(zhì)量小,不需要切割,也不影響融合蛋白的生物學(xué)活性,本研究采用尿素溶解、低濃度的復(fù)性液復(fù)性、PBS透析等方法對重組融合蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性,得到的蛋白純度可達(dá)90%以上,純化過程免去了過鎳-鉻金屬螯合劑親和層析柱的步驟,具有成本低廉,操作簡單,純化效果好、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點。采用PEG20000濃縮后的蛋白濃度可達(dá)1.2 mg/mL,完全可以滿足佐劑的使用劑量。此方法也存在一定的缺陷,純化復(fù)性后的蛋白極不穩(wěn)定,4℃放置不到1周即有沉淀產(chǎn)生,這可能與原核表達(dá)的重組蛋白未糖基化有關(guān),如果要長時間保存,可以進(jìn)行凍干保存。

試驗中制備多克隆抗體所選用的家兔對重組蛋白反應(yīng)良好,三免后ELISA檢測抗體效價即可達(dá)到1∶12 800以上,用此制備的抗體作為一抗稀釋500倍后做Wester blot檢測原核表達(dá)的IL-2和IL-6的串聯(lián)蛋白有明顯的反應(yīng),特異性較好(待發(fā)表)。此外,此抗體還可用于檢測豬體內(nèi)IL-2和IL-6的含量水平,評價豬體的免疫狀態(tài),為以后佐劑的使用劑量提供參考依據(jù)。

[1]Camille A,Flamme L,Pearce E J.T he absence of IL-6 does not affect T h2 cell developmentin vivo,but does lead to impaired proliferation,IL-2 receptor expression,and B cell responses[J].J Immunol,1999,162:5829-5837.

[2]Uyttenhove C,Coulie P G,Snick J V.T cell growth and differ-entiation induced by ineterleukin-HP1/IL-6,the murine hybridoma/plastocytoma growth factor[J].J Exp Med,1988,167:1417-1427.

[3]Joseph S B,Miner K T,Croft M.Augmentation of naive,Th1 and Th2 effector CD4 responses by IL-6,IL-l,and T NF[J].Eur J Immunol,1998,28(l):277-289.

[4]嚴(yán) 琳,何啟蓋,陳煥春,等.豬IL-2與IL-6的原核表達(dá)及其對偽狂犬病基因缺失疫苗的佐劑效應(yīng)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(10):1213-1218.

[5]張 芳,郭萬柱,吳 華.榮昌豬白細(xì)胞介素-2基因的原核表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29(5):355-358.

[6]范俊娟,陳 建,余興龍,等.豬白細(xì)胞介素-6基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物的促淋巴細(xì)胞增殖活性[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008(6):531-534.

[7]景志忠,竇永喜,羅啟慧,等.豬白介素家族重要基因的克隆表達(dá)及其結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(3):612-619.

[8]田國寶.豬白細(xì)胞介素2、4分子佐劑對豬口蹄疫疫苗免疫增強作用研究[D].四川雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[9]Yang Y,Chen J,Li H,et al.Porcine interleukin-2 gene encapsulated in chitosan nanoparticles enhances immune response of mice to piglet paratyphoid vaccine[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2007,30(1):19-32.

[10]蘇 丹,李 棟,程 馳,等.改組豬 IL-2基因與CpG序列對豬偽狂犬病滅活疫苗免疫應(yīng)答的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008,38(9):767-771.

[11]Zhang L,Tian X,Guo Y,et al.Effect of transgenic expression of porcine interleukin-6 gene and CpG sequences on immune responses of newborn piglets inoculated with pseudorabies attenuated vaccine[J].Res Vet Sci,2006,80(3):281-286.

[12]Wu M,Gao R,Meng M,et al.Regulating effects of porcine interleukin-6 gene and CpG motifs on immune responses to porcine trivalent vaccines in mice[J].Res Vet Sci,2004,77(1):49-57.

[13]陳建林,楊 肖,章 歡,等.豬白細(xì)胞介素4、6融合基因和CpG基序?qū)ωi藍(lán)耳病疫苗免疫的強化效應(yīng)[J].四川動物,2008,27(6):1012-1016.

[14]嚴(yán) 琳.豬白細(xì)胞介素2與豬白細(xì)胞介素6的基因表達(dá)及作為疫苗佐劑的研究[D].湖北武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005:104.

Prokaryotic Expression and Preparation of Polyclonal Antibody for Porcine Interleukin-2 and Interleukin-6

ZHEN Hong-hua1,SHEN Zhi-qiang2,SHAN Hu1,WANG Jin-liang2

(1.College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong266109,China;2.Shandong Binzhou Animal Science And Veterinary Medicine Institute,Binzhou,Shandong,256600,China)

The interleukin-2(IL-2)and interleukin-6(IL-6)are the important factors for immunoloregulation,and have great development prospects in the application of adjuvants.The genes of porcine IL-2 and IL-6 were amplified from recombinant plasmid pTIL-2 and pTIL-6.After being digested by restriction endonucleases,the IL-2 and IL-6 genes were subcloned into the prokaryotic expression vector pET30a.After restriction enzyme digestion,PCR identification and sequence analysis of the recombinant plasmids,the positive recombinant plasmids were selected and designated as pETIL-2 and pETIL-6.The pETIL-2 and pETIL-6 were transformed intoE.coliBL21(DE3)and Rosetta(DE3)and then induced with IPTG at 37℃.SDS-PAGE and Western-blotting analysis showed that the expressed recombinant IL-2 and IL-6 proteins presented in inclusion bodies and were about 26ku and 30ku in molecular weight.The recombinant IL-2 and IL-6 protein which were purified and refolded were used to immunize rabbit for specific IL-2/IL-6 antibody generation.

porcine interleukin-2;porcine interleukin-6;prokaryotic expression;polyclonal antibody

S858.28;S852.4

A

1007-5038(2010)02-0060-05*

2009-10-10

甄洪花(1985-),女,山東濟(jì)南人,碩士研究生,主要從事獸醫(yī)生物制品學(xué)研究。*通訊作者