詹愛(ài)軍,王新衛(wèi),陳書(shū)琨,孫 潔,陳 兵,阮周曦,花群義*

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳 518010;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片檢測(cè)方法的建立*

詹愛(ài)軍1,王新衛(wèi)2,陳書(shū)琨1,孫 潔1,陳 兵1,阮周曦1,花群義1*

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳 518010;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

為建立可檢測(cè)鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速檢測(cè)技術(shù),用DNA Star軟件對(duì)GenBank中EHDV的VP7基因進(jìn)行序列分析,設(shè)計(jì)EHDV特異性探針并用生物素標(biāo)記,與熒光編碼微球偶聯(lián)后與病毒VP7基因的PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng),用液相芯片檢測(cè)儀(Liquichip 200)檢測(cè)熒光信號(hào)建立了EHDV快速高通量液相芯片檢測(cè)方法。檢測(cè)結(jié)果顯示,該法具有較好的特異性,不與其他蟲(chóng)媒病病毒反應(yīng);檢測(cè)靈敏度為100個(gè) TCID50。建立了快速檢測(cè)EHDV的液相芯片技術(shù),為進(jìn)一步搭建EHDV快速高通量檢測(cè)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。

流行性出血病病毒;液相芯片;檢測(cè)

鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)引起的,以白尾鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血并常處于昏迷狀態(tài)下死亡為特征的嚴(yán)重致死性蟲(chóng)媒病[1]。EHDV于1955年首次在美國(guó)新澤西州的白尾鹿中分離到,隨后加拿大、日本、南非、澳大利亞和尼日利亞都分離到EHDV[2]。由于此病危害較大,嚴(yán)重影響著許多國(guó)家的畜牧業(yè)和國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展,我國(guó)已將EHD列為二類傳染病,但國(guó)內(nèi)對(duì)此病研究較少[2-3]。雖然我國(guó)目前還沒(méi)有EHD發(fā)生,但是由于EHDV已存在于周邊國(guó)家(如日本、朝鮮)[4],有傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn),因此應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

液相芯片檢測(cè)技術(shù)是一個(gè)全新的快速高通量檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)集流式細(xì)胞技術(shù)、熒光編碼微球、激光、數(shù)字信號(hào)處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體[5-10],具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),通過(guò)高通量手段可降低成本和勞動(dòng)力;檢測(cè)樣本量需求少,可通過(guò)液相熒光編碼微球芯片的方法,在自然的液相反應(yīng)條件下縮短檢測(cè)時(shí)間;相對(duì)于固相平板芯片,液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)更快速,重復(fù)性更好;1種～100種靈活多重檢測(cè),滿足多種檢測(cè)需求,開(kāi)發(fā)平臺(tái)可適用于多種檢測(cè)試劑和軟件的開(kāi)發(fā)。此外,該方法避免了RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等常規(guī)方法的不能滿足出入境高通量檢疫的缺點(diǎn)[11-12]。鑒于此,筆者依據(jù)實(shí)際需要,采用PCR檢測(cè)方法與液相芯片檢測(cè)技術(shù)結(jié)合,初步建立EHDV液相芯片快速檢測(cè)方法,為快速、高通量檢測(cè)EHD提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和試劑 帶有藍(lán)舌病病毒(BTV)的VP7基因的質(zhì)粒PMT-BTV-VP7、水皰性口炎病毒(VSV)的NP基因質(zhì)粒 PM T-VSV-NP、EHDV的VP7基因質(zhì)粒 PMT-EHDV-VP7、阿卡斑病毒(AKV)的N基因質(zhì)粒PMT-AKV-N和西尼羅病毒(EHDV)的E基因質(zhì)粒PM T-EHDV-E由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室(下為本室)構(gòu)建,帶有質(zhì)粒的菌株由本室保存。EHDV由本室保存,所有樣品為進(jìn)口凍品。

Mini BEST Plasmid Purification Kit(2.0)、PCR Amplification Kit和DNA Fragment purification kit(2.0)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,Qiagen Viral RNA Mini Kit、Qiagen OneStep RTPCR Kit與EZ1 Virus mini Kit2.0為 Qiagen公司產(chǎn)品;EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodimide hydrochloride)為 Pierce公司產(chǎn)品;Streptavidin R-Phycoerythrin Lumi Grade為Roche Applied Science公司產(chǎn)品;0.5 mol/L MES(2-[NMorpholino]ethanesulfonic acid hydrate)Solution為 Fluka公司產(chǎn)品 ;Tween 20、SDS 、100 mL/L so-lution 、Sarkosyl、TE(T ris-EDTA)buffer(pH 8.0,100×)、5 mol/L TMAC(Tetramethylammonium chloride solution)、1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)與Sodium ChlorideTriton X-100為Sigma公司產(chǎn)品,所用各種表面含有羧基的熒光編碼微球來(lái)自Luminex和Qiagen公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 小型全自動(dòng)核酸抽提工作站,高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),梯度核酸擴(kuò)增儀,梯度核酸擴(kuò)增儀,液相芯片檢測(cè)工作站,凝膠成像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 選取不同國(guó)家和地區(qū)的GenBank上EHDV的VP7基因序列,進(jìn)行序列在線分析后利用DNA Star(V.5.0)分析,找出基因中最保守的25個(gè)寡核苷酸(oligo nucleotide,nt)作為液相芯片檢測(cè)探針,探針Tm值在60℃～62℃,在其5′端標(biāo)記-NH2。分別在探針的上下游設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物。同時(shí)根據(jù)探針的序列設(shè)計(jì)其反向互補(bǔ)序列作為建立反應(yīng)體系的陽(yáng)性對(duì)照。探針及反向互補(bǔ)序列、引物的序列如下:EHD VP7,206 bp(387 ～ 592),Tm=79 ℃,P1:5′-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3′;P2:5′-CCGCTGCAT TCGAAAAAGTC-3′;Probe:5′-ATCGTATCCTCGACTT TAGCTCAGG-3′;RC-Probe:5′-CCTGAGCTAAAGTCGAGGATACGAT-3′。引物、探針?biāo)蚐igma公司合成,下游引物的5′端標(biāo)記生物素,Probe的5′-C6標(biāo)記氨基,探針?lè)聪蚧パa(bǔ)序列RC-Probe的5′端標(biāo)記生物素。引物用水溶解成200 μ mol/L貯存母液備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系的建立 用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提帶有EHDV的VP7基因質(zhì)粒PMT-EHDV-VP7,按照PCR Amplification Kit Handbook推薦的方法建立 EHDV VP7基因通用PCR檢測(cè)方法,同時(shí)以鮭魚(yú)精子蛋白基因DNA片段做為陰性對(duì)照。PCR的反應(yīng)體系如下(50 μ L):RNase-free H2O 31 μ L;10 × Qiagen onestep RT-PCR buffer10 μ L;dNTP mix(10 mmol/L/each)4 μ L;Taq(5 U/μ L)2 μ L;primer*P1(20 μ mol/L ～ 80 μ mol/L)1 μ L;template(Plasmid DNA)2 μ L;primer*P2(20 μ mol/L～ 80 μ mol/L)2 μ L。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;94 ℃30 s,52℃1 min 30 s,72℃1 min,15個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。用Qiagen Viral RNA Mini Kit抽提EHDV RNA,同樣按照 Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook推薦的方法建立50 μ L EHDV基因通用 RT-PCR檢測(cè)方法。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μ L RTPCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.2.3 EHDV核酸液相芯片(PLex)檢測(cè)體系的建立

1.2.3.1 EDC一步法偶聯(lián)寡核苷酸探針與Luminex羧基化的熒光編碼微球 按照Luminex推薦的熒光編碼微球序號(hào),與EHDV的VP7基因的特異性寡核苷酸探針一一對(duì)應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián),熒光編碼微球與探針的偶聯(lián)參照Luminex推薦操作步驟進(jìn)行[13-14]。偶聯(lián)后與其RC-Probe進(jìn)行雜交反應(yīng),并設(shè)空白對(duì)照,以確定偶聯(lián)是否有效。根據(jù)Luminex公司推薦的判定標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)每種熒光編碼微球個(gè)數(shù)不少于20個(gè)且背景空白熒光強(qiáng)度不高于500,表明試驗(yàn)成立,進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.3.2 EHDV液相芯片檢測(cè)體系的建立 為驗(yàn)證探針偶聯(lián)的熒光編碼微球與與EHDV的VP7基因的PCR產(chǎn)物之間能否正確雜交,取PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物,按照 Luminex推薦的液相芯片步驟,將EHDV基因探針偶聯(lián)的相應(yīng)熒光編碼微球與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交,建立基因偶聯(lián)探針的熒光編碼微球檢測(cè)體系。設(shè)置儀器每次只檢測(cè)相應(yīng)編碼的熒光編碼微球,將上樣加熱陶瓷底板預(yù)先加熱至52℃后取樣品上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同1.2.3.1。

液相芯片定性比值結(jié)果(luminex qualitative ratio result,LQRR)等于樣品的校正后的熒光強(qiáng)度中位值(median florescence intensity,MFI)與空白對(duì)照MFI的平均值(MFIB)的比值,即 LQRR=MFIS/MFIB。如果 LQRR≥3,判定為陽(yáng)性樣本;如果2≤LQRR≤3,則判定為可疑;如果LQRR＜2,則判定為陰性。

1.2.4 PLex快速檢測(cè)方法靈敏性試驗(yàn) 為確定PLex快速檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度,將抽提的 EHDV的VP7基因的質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋至10-8;將EHDV的滅活溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋至 10-6約 1 TCID50,抽提 RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。按所建立的方法,確定該方法的靈敏度。

1.2.5 PLex快速檢測(cè)方法特異性試驗(yàn) 分別取帶有BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因、AKV的N基因和EHDV的VP7基因的質(zhì)粒作為模板,按照1.2.2的方法進(jìn)行這些基因的PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物與EHDV基因探針偶聯(lián)的相應(yīng)熒光編碼微球進(jìn)行雜交,檢測(cè)所建方法的特異性。

1.2.6 PLex快速檢測(cè)方法與RT-PCR比對(duì)試驗(yàn) 利用本研究建立的PLex快速檢測(cè)方法,檢測(cè)100份實(shí)驗(yàn)室保存的進(jìn)口凍品樣品,將所建立的方法與RTPCR方法對(duì)比,從而評(píng)價(jià)其可靠性及臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

PCR在反應(yīng)體系中其它條件相同的條件下,確定的最佳引物終濃度分別為 0.1 μ mol/L～0.2 μ mol/L,2.5 mmol/L MgCl2的濃度為反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。以此條件建立了EHDV PCR檢測(cè)方法。

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

帶有EHDV VP7基因的質(zhì)粒PCR檢測(cè),可特異性地?cái)U(kuò)增出所需要的目的條帶,約206 bp,與理論結(jié)果相符(圖1)。

圖1 EHDV的PCR和RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR and RT-PCR products of EHDV

2.3 PLex檢測(cè)體系的建立

EHDV探針與相應(yīng)熒光編碼的熒光編碼微球偶聯(lián)后,與相應(yīng)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物直接雜交后顯示,各個(gè)參與計(jì)數(shù)的熒光編碼微球均≥20個(gè),表明用于計(jì)數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效,所產(chǎn)生的MFI值可信;各個(gè)熒光編碼微球的空白對(duì)照MFI均＜500,表明結(jié)果有效,試驗(yàn)可以進(jìn)行結(jié)果判定;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的MFI明顯大于陰性和空白對(duì)照的值。探針與相應(yīng)的PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物之間均有特異性的雜交,LQRR值都大于10,表明均為陽(yáng)性(表1)。

2.4 PLex快速檢測(cè)方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

將抽提的帶有EHDV VP7基因的質(zhì)粒定量后以10倍梯度稀釋,進(jìn)行EHDV VP7基因片段的PCR擴(kuò)增、純化后進(jìn)行PLex快速檢測(cè)。結(jié)果表明(表2),PLex快速檢測(cè)方法檢測(cè)EHDV VP7基因的檢測(cè)靈敏度為10-5,LQRR值約為3.225,通過(guò)計(jì)算相當(dāng)于50拷貝;檢測(cè)病毒稀釋液靈敏度為10-4,LQRR值約為3.23,通過(guò)計(jì)算相當(dāng)于100 TCID50

2.5 PLex快速檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)帶有BTV的VP7基因、VSV的 NP基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和WNV的E基因的質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果顯示探針與相應(yīng)的EHDV的VP7基因PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物之間有特異性的雜交,EHDV的 LQRR值都大于10,表明均為陽(yáng)性,而與BTV 的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR產(chǎn)物L(fēng)QRR值都小于2,而空白對(duì)照的值很低,低于500(表3),說(shuō)明建立的PLex檢測(cè)方法特異性強(qiáng),方法成立。

2.6 PLex方法與傳統(tǒng)方法比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)100份實(shí)驗(yàn)室保存的進(jìn)口凍品樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,該法與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致,均為陰性,未出現(xiàn)假陽(yáng)性。

表 1 EHDV PLex檢測(cè)MFI值Table 1 M FI value of PLex for EHDV

表2 PLex檢測(cè)EHDV的靈敏度Table 2 The sensitivity test of PLex for EHDV

表3 PLex檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The specificity test of P Lex for EHDV

3 討論

液相芯片檢測(cè)技術(shù)是一個(gè)全新的快速高通量檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)中采用的熒光編碼微球達(dá)100種,可對(duì)100種目標(biāo)同時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè),PLex快速高通量檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)主要是能夠快速高通量鑒定病毒的存在,通過(guò)高通量手段可降低成本和勞動(dòng)力;檢測(cè)樣本量需求少,可通過(guò)液相熒光編碼微球芯片的方法,在自然的液相反應(yīng)條件下縮短檢測(cè)時(shí)間[15-17]。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí),最佳探針與熒光編碼微球偶聯(lián)的比例需要進(jìn)行梯度滴定。研究顯示,在50 μ L MES偶聯(lián)體系中,EDC的終濃度越高,偶聯(lián)效果越好,1.0 mg/mL的濃度偶聯(lián)效果明顯好于0.5 mg/mL。但熒光編碼微球的加入量并非越多越好,過(guò)多反而影響與探針的偶聯(lián)效率,導(dǎo)致雜交信號(hào)MFI過(guò)低。只要探針的濃度相同,與不同量的探針雜交結(jié)果相同。探針的長(zhǎng)度等也影響檢測(cè)結(jié)果,在研究中發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的EHDV VP7基因的探針?lè)浅Ｌ禺?與BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物之間無(wú)交叉反應(yīng),對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的100份凍存樣品檢測(cè)的結(jié)果與RTPCR方法一致,沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性。試驗(yàn)中由于沒(méi)有陽(yáng)性的病毒樣品,所以還無(wú)法確定是否會(huì)出現(xiàn)假陰性。

本文將PCR方法與Liqui Chip檢測(cè)方法結(jié)合,初步建立了EHDV PLex快速高通量檢測(cè)方法,搭建了EHDV全新快速高通量檢測(cè)平臺(tái)。這為防止該病進(jìn)入我國(guó)提供了技術(shù)儲(chǔ)備,也為其他同類病毒的快速高通量檢測(cè)提供了借鑒和經(jīng)驗(yàn)。

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Development of Liquichip Detection Technique for Detecting Epizootic Hemorrhagic Disease Virus of Deer

ZHAN Ai-jun1,WANG Xin-wei2,CHEN Shu-kun1,SUN Jie1,CHEN Bing1,RUAN Zhou-xi1,H UA Qun-yi1

(1.Technical Center of Animal and Plant Quarantine Inspection,Shenzhen CIQ,Shenzhen,Guangdong,518010,China;2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou,Henan,450002,China)

To develop liquichip method for detecting epizootic haemorrhagic disease virus of deer,the VP7 gene of EHDV published in the GenBank was analyzed by using the software DNAStar 5.0,and specific EHDV probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres,which was used for hybridization reaction to RT-PCR products of EHDV.Liquichip detection method for detecting EHDV was established by using Liquichip 200 to detect fluorescence signal in the reaction system.The results demonstrated that this detection method showed better specificity to EHDV and no reaction with other insect-borne disease viruses.The sensitivity test indicated that the detecting limit for the EHDV could reach to 100 TCID50.These results suggested that the developed Liquichip detection technique provided a foundation for further research on rapidly high throughput detection for EHDV and also for exploration to detect other viruses with the same way.

Epizootic haemorrhagic disease virus;liquichip;detection

S858.25;S852.65

A

1007-5038(2010)02-0036-05

2009-09-24

科技部“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z445);國(guó)家質(zhì)檢總局資助項(xiàng)目(2008IK011)

詹愛(ài)軍(1970-),男,江蘇揚(yáng)州人,博士后,主要從事分子病毒學(xué)和免疫學(xué)研究。*通訊作者