詹愛軍,王新衛(wèi),陳書琨,孫 潔,陳 兵,阮周曦,花群義*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,廣東深圳 518010;2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南鄭州 450002)

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片檢測方法的建立*

詹愛軍1,王新衛(wèi)2,陳書琨1,孫 潔1,陳 兵1,阮周曦1,花群義1*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,廣東深圳 518010;2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南鄭州 450002)

為建立可檢測鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速檢測技術,用DNA Star軟件對GenBank中EHDV的VP7基因進行序列分析,設計EHDV特異性探針并用生物素標記,與熒光編碼微球偶聯(lián)后與病毒VP7基因的PCR產(chǎn)物雜交反應,用液相芯片檢測儀(Liquichip 200)檢測熒光信號建立了EHDV快速高通量液相芯片檢測方法。檢測結果顯示,該法具有較好的特異性,不與其他蟲媒病病毒反應;檢測靈敏度為100個 TCID50。建立了快速檢測EHDV的液相芯片技術,為進一步搭建EHDV快速高通量檢測平臺奠定了基礎。

流行性出血病病毒;液相芯片;檢測

鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)引起的,以白尾鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血并常處于昏迷狀態(tài)下死亡為特征的嚴重致死性蟲媒病[1]。EHDV于1955年首次在美國新澤西州的白尾鹿中分離到,隨后加拿大、日本、南非、澳大利亞和尼日利亞都分離到EHDV[2]。由于此病危害較大,嚴重影響著許多國家的畜牧業(yè)和國際貿易的發(fā)展,我國已將EHD列為二類傳染病,但國內對此病研究較少[2-3]。雖然我國目前還沒有EHD發(fā)生,但是由于EHDV已存在于周邊國家(如日本、朝鮮)[4],有傳入我國的風險,因此應加強監(jiān)測。

液相芯片檢測技術是一個全新的快速高通量檢測技術,該技術集流式細胞技術、熒光編碼微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)的生化技術于一體[5-10],具有獨特的優(yōu)點,通過高通量手段可降低成本和勞動力;檢測樣本量需求少,可通過液相熒光編碼微球芯片的方法,在自然的液相反應條件下縮短檢測時間;相對于固相平板芯片,液相反應動力學反應更快速,重復性更好;1種～100種靈活多重檢測,滿足多種檢測需求,開發(fā)平臺可適用于多種檢測試劑和軟件的開發(fā)。此外,該方法避免了RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等常規(guī)方法的不能滿足出入境高通量檢疫的缺點[11-12]。鑒于此,筆者依據(jù)實際需要,采用PCR檢測方法與液相芯片檢測技術結合,初步建立EHDV液相芯片快速檢測方法,為快速、高通量檢測EHD提供了技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和試劑 帶有藍舌病病毒(BTV)的VP7基因的質粒PMT-BTV-VP7、水皰性口炎病毒(VSV)的NP基因質粒 PM T-VSV-NP、EHDV的VP7基因質粒 PMT-EHDV-VP7、阿卡斑病毒(AKV)的N基因質粒PMT-AKV-N和西尼羅病毒(EHDV)的E基因質粒PM T-EHDV-E由深圳出入境檢驗檢疫局動植物中心動檢實驗室(下為本室)構建,帶有質粒的菌株由本室保存。EHDV由本室保存,所有樣品為進口凍品。

Mini BEST Plasmid Purification Kit(2.0)、PCR Amplification Kit和DNA Fragment purification kit(2.0)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,Qiagen Viral RNA Mini Kit、Qiagen OneStep RTPCR Kit與EZ1 Virus mini Kit2.0為 Qiagen公司產(chǎn)品;EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodimide hydrochloride)為 Pierce公司產(chǎn)品;Streptavidin R-Phycoerythrin Lumi Grade為Roche Applied Science公司產(chǎn)品;0.5 mol/L MES(2-[NMorpholino]ethanesulfonic acid hydrate)Solution為 Fluka公司產(chǎn)品 ;Tween 20、SDS 、100 mL/L so-lution 、Sarkosyl、TE(T ris-EDTA)buffer(pH 8.0,100×)、5 mol/L TMAC(Tetramethylammonium chloride solution)、1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)與Sodium ChlorideTriton X-100為Sigma公司產(chǎn)品,所用各種表面含有羧基的熒光編碼微球來自Luminex和Qiagen公司。

1.1.2 主要儀器設備 小型全自動核酸抽提工作站,高速臺式冷凍離心機,梯度核酸擴增儀,梯度核酸擴增儀,液相芯片檢測工作站,凝膠成像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設計與合成 選取不同國家和地區(qū)的GenBank上EHDV的VP7基因序列,進行序列在線分析后利用DNA Star(V.5.0)分析,找出基因中最保守的25個寡核苷酸(oligo nucleotide,nt)作為液相芯片檢測探針,探針Tm值在60℃～62℃,在其5′端標記-NH2。分別在探針的上下游設計特異性的擴增引物。同時根據(jù)探針的序列設計其反向互補序列作為建立反應體系的陽性對照。探針及反向互補序列、引物的序列如下:EHD VP7,206 bp(387 ～ 592),Tm=79 ℃,P1:5′-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3′;P2:5′-CCGCTGCAT TCGAAAAAGTC-3′;Probe:5′-ATCGTATCCTCGACTT TAGCTCAGG-3′;RC-Probe:5′-CCTGAGCTAAAGTCGAGGATACGAT-3′。引物、探針送Sigma公司合成,下游引物的5′端標記生物素,Probe的5′-C6標記氨基,探針反向互補序列RC-Probe的5′端標記生物素。引物用水溶解成200 μ mol/L貯存母液備用。

1.2.2 PCR擴增體系的建立 用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提帶有EHDV的VP7基因質粒PMT-EHDV-VP7,按照PCR Amplification Kit Handbook推薦的方法建立 EHDV VP7基因通用PCR檢測方法,同時以鮭魚精子蛋白基因DNA片段做為陰性對照。PCR的反應體系如下(50 μ L):RNase-free H2O 31 μ L;10 × Qiagen onestep RT-PCR buffer10 μ L;dNTP mix(10 mmol/L/each)4 μ L;Taq(5 U/μ L)2 μ L;primer*P1(20 μ mol/L ～ 80 μ mol/L)1 μ L;template(Plasmid DNA)2 μ L;primer*P2(20 μ mol/L～ 80 μ mol/L)2 μ L。反應程序:95 ℃ 3 min;94 ℃30 s,52℃1 min 30 s,72℃1 min,15個循環(huán);72℃延伸10 min。用Qiagen Viral RNA Mini Kit抽提EHDV RNA,同樣按照 Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook推薦的方法建立50 μ L EHDV基因通用 RT-PCR檢測方法。反應結束后,取5 μ L RTPCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.3 EHDV核酸液相芯片(PLex)檢測體系的建立

1.2.3.1 EDC一步法偶聯(lián)寡核苷酸探針與Luminex羧基化的熒光編碼微球 按照Luminex推薦的熒光編碼微球序號,與EHDV的VP7基因的特異性寡核苷酸探針一一對應進行偶聯(lián),熒光編碼微球與探針的偶聯(lián)參照Luminex推薦操作步驟進行[13-14]。偶聯(lián)后與其RC-Probe進行雜交反應,并設空白對照,以確定偶聯(lián)是否有效。根據(jù)Luminex公司推薦的判定標準,當每種熒光編碼微球個數(shù)不少于20個且背景空白熒光強度不高于500,表明試驗成立,進行結果判定。

1.2.3.2 EHDV液相芯片檢測體系的建立 為驗證探針偶聯(lián)的熒光編碼微球與與EHDV的VP7基因的PCR產(chǎn)物之間能否正確雜交,取PCR的擴增產(chǎn)物,按照 Luminex推薦的液相芯片步驟,將EHDV基因探針偶聯(lián)的相應熒光編碼微球與擴增產(chǎn)物進行雜交,建立基因偶聯(lián)探針的熒光編碼微球檢測體系。設置儀器每次只檢測相應編碼的熒光編碼微球,將上樣加熱陶瓷底板預先加熱至52℃后取樣品上機進行檢測。結果判定標準同1.2.3.1。

液相芯片定性比值結果(luminex qualitative ratio result,LQRR)等于樣品的校正后的熒光強度中位值(median florescence intensity,MFI)與空白對照MFI的平均值(MFIB)的比值,即 LQRR=MFIS/MFIB。如果 LQRR≥3,判定為陽性樣本;如果2≤LQRR≤3,則判定為可疑;如果LQRR＜2,則判定為陰性。

1.2.4 PLex快速檢測方法靈敏性試驗 為確定PLex快速檢測方法檢測靈敏度,將抽提的 EHDV的VP7基因的質粒DNA進行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋至10-8;將EHDV的滅活溶液進行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋至 10-6約 1 TCID50,抽提 RNA,進行RT-PCR擴增。按所建立的方法,確定該方法的靈敏度。

1.2.5 PLex快速檢測方法特異性試驗 分別取帶有BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因、AKV的N基因和EHDV的VP7基因的質粒作為模板,按照1.2.2的方法進行這些基因的PCR擴增,將擴增產(chǎn)物與EHDV基因探針偶聯(lián)的相應熒光編碼微球進行雜交,檢測所建方法的特異性。

1.2.6 PLex快速檢測方法與RT-PCR比對試驗 利用本研究建立的PLex快速檢測方法,檢測100份實驗室保存的進口凍品樣品,將所建立的方法與RTPCR方法對比,從而評價其可靠性及臨床實用性。

2 結果

2.1 PCR檢測方法的建立與優(yōu)化

PCR在反應體系中其它條件相同的條件下,確定的最佳引物終濃度分別為 0.1 μ mol/L～0.2 μ mol/L,2.5 mmol/L MgCl2的濃度為反應體系中的鎂離子濃度。以此條件建立了EHDV PCR檢測方法。

2.2 PCR檢測結果

帶有EHDV VP7基因的質粒PCR檢測,可特異性地擴增出所需要的目的條帶,約206 bp,與理論結果相符(圖1)。

圖1 EHDV的PCR和RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR and RT-PCR products of EHDV

2.3 PLex檢測體系的建立

EHDV探針與相應熒光編碼的熒光編碼微球偶聯(lián)后,與相應的PCR反應擴增產(chǎn)物直接雜交后顯示,各個參與計數(shù)的熒光編碼微球均≥20個,表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效,所產(chǎn)生的MFI值可信;各個熒光編碼微球的空白對照MFI均＜500,表明結果有效,試驗可以進行結果判定;PCR擴增產(chǎn)物的MFI明顯大于陰性和空白對照的值。探針與相應的PCR擴增的陽性產(chǎn)物之間均有特異性的雜交,LQRR值都大于10,表明均為陽性(表1)。

2.4 PLex快速檢測方法靈敏性試驗結果

將抽提的帶有EHDV VP7基因的質粒定量后以10倍梯度稀釋,進行EHDV VP7基因片段的PCR擴增、純化后進行PLex快速檢測。結果表明(表2),PLex快速檢測方法檢測EHDV VP7基因的檢測靈敏度為10-5,LQRR值約為3.225,通過計算相當于50拷貝;檢測病毒稀釋液靈敏度為10-4,LQRR值約為3.23,通過計算相當于100 TCID50

2.5 PLex快速檢測方法特異性試驗結果

對帶有BTV的VP7基因、VSV的 NP基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和WNV的E基因的質粒的檢測結果顯示探針與相應的EHDV的VP7基因PCR擴增的陽性產(chǎn)物之間有特異性的雜交,EHDV的 LQRR值都大于10,表明均為陽性,而與BTV 的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR產(chǎn)物LQRR值都小于2,而空白對照的值很低,低于500(表3),說明建立的PLex檢測方法特異性強,方法成立。

2.6 PLex方法與傳統(tǒng)方法比對試驗結果

對100份實驗室保存的進口凍品樣品檢測結果顯示,該法與RT-PCR檢測結果完全一致,均為陰性,未出現(xiàn)假陽性。

表 1 EHDV PLex檢測MFI值Table 1 M FI value of PLex for EHDV

表2 PLex檢測EHDV的靈敏度Table 2 The sensitivity test of PLex for EHDV

表3 PLex檢測方法特異性試驗結果Table 3 The specificity test of P Lex for EHDV

3 討論

液相芯片檢測技術是一個全新的快速高通量檢測技術。該技術中采用的熒光編碼微球達100種,可對100種目標同時、準確地檢測,PLex快速高通量檢測方法的優(yōu)點主要是能夠快速高通量鑒定病毒的存在,通過高通量手段可降低成本和勞動力;檢測樣本量需求少,可通過液相熒光編碼微球芯片的方法,在自然的液相反應條件下縮短檢測時間[15-17]。在進行檢測時,最佳探針與熒光編碼微球偶聯(lián)的比例需要進行梯度滴定。研究顯示,在50 μ L MES偶聯(lián)體系中,EDC的終濃度越高,偶聯(lián)效果越好,1.0 mg/mL的濃度偶聯(lián)效果明顯好于0.5 mg/mL。但熒光編碼微球的加入量并非越多越好,過多反而影響與探針的偶聯(lián)效率,導致雜交信號MFI過低。只要探針的濃度相同,與不同量的探針雜交結果相同。探針的長度等也影響檢測結果,在研究中發(fā)現(xiàn)設計的EHDV VP7基因的探針非常特異,與BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR陽性產(chǎn)物之間無交叉反應,對實驗室保存的100份凍存樣品檢測的結果與RTPCR方法一致,沒有出現(xiàn)假陽性。試驗中由于沒有陽性的病毒樣品,所以還無法確定是否會出現(xiàn)假陰性。

本文將PCR方法與Liqui Chip檢測方法結合,初步建立了EHDV PLex快速高通量檢測方法,搭建了EHDV全新快速高通量檢測平臺。這為防止該病進入我國提供了技術儲備,也為其他同類病毒的快速高通量檢測提供了借鑒和經(jīng)驗。

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Development of Liquichip Detection Technique for Detecting Epizootic Hemorrhagic Disease Virus of Deer

ZHAN Ai-jun1,WANG Xin-wei2,CHEN Shu-kun1,SUN Jie1,CHEN Bing1,RUAN Zhou-xi1,H UA Qun-yi1

(1.Technical Center of Animal and Plant Quarantine Inspection,Shenzhen CIQ,Shenzhen,Guangdong,518010,China;2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou,Henan,450002,China)

To develop liquichip method for detecting epizootic haemorrhagic disease virus of deer,the VP7 gene of EHDV published in the GenBank was analyzed by using the software DNAStar 5.0,and specific EHDV probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres,which was used for hybridization reaction to RT-PCR products of EHDV.Liquichip detection method for detecting EHDV was established by using Liquichip 200 to detect fluorescence signal in the reaction system.The results demonstrated that this detection method showed better specificity to EHDV and no reaction with other insect-borne disease viruses.The sensitivity test indicated that the detecting limit for the EHDV could reach to 100 TCID50.These results suggested that the developed Liquichip detection technique provided a foundation for further research on rapidly high throughput detection for EHDV and also for exploration to detect other viruses with the same way.

Epizootic haemorrhagic disease virus;liquichip;detection

S858.25;S852.65

A

1007-5038(2010)02-0036-05

2009-09-24

科技部“863”計劃項目(2006AA10Z445);國家質檢總局資助項目(2008IK011)

詹愛軍(1970-),男,江蘇揚州人,博士后,主要從事分子病毒學和免疫學研究。*通訊作者