游 猛,潘志明,耿士忠,馬全剛,方 強(qiáng),焦新安

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與新城疫病毒F蛋白的融合表達(dá)及免疫原性分析*

游 猛,潘志明*,耿士忠,馬全剛,方 強(qiáng),焦新安*

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)2編碼序列將二者串聯(lián)并克隆到質(zhì)粒pET30a+上,獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC-F,將其轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá)。Western blot證實(shí)重組菌表達(dá)的fliC-F融合蛋白能與小鼠抗fliC和抗F蛋白兩種多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。動(dòng)物試驗(yàn)顯示,fliC-F融合蛋白能夠刺激C3H/HeJ小鼠產(chǎn)生針對(duì)F蛋白的特異性血清抗體,說(shuō)明原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的fliC-F融合蛋白具有較好的免疫原性。

鼠傷寒沙門菌;鞭毛蛋白;新城疫病毒;融合蛋白;免疫原性

新城疫(Newcastle disease,ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)確定為法定報(bào)告疾病,免疫預(yù)防是控制該病的重要手段。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的融合蛋白(F)除了參與病毒的穿透、細(xì)胞融合,與病毒的致病性有關(guān)外,還具有良好的免疫原性,是NDV亞單位疫苗研究的主要目的抗原[1]。

Janeway C A[2]首次提出,機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原物質(zhì)如對(duì)病原微生物的識(shí)別是由細(xì)胞的特定受體介導(dǎo)的。目前已證實(shí),這一識(shí)別主要是通過(guò)細(xì)胞表面的Toll樣受體(T oll-like receptor,TLRs)家族分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。T LRs可識(shí)別病原微生物高度保守的結(jié)構(gòu)基序,即所謂的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并誘導(dǎo)產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答[3]。特定的 TLRs可以識(shí)別相應(yīng)的PAMPs,其中T LR5識(shí)別鞭毛蛋白[4]。鞭毛蛋白作為天然免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然免疫應(yīng)答可幫助建立針對(duì)外源抗原的獲得性免疫應(yīng)答,從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的效應(yīng)[5]。Cuadros C等[6]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的融合蛋白作用骨髓源抗原遞呈細(xì)胞(BMDCs),可刺激BMDCs成熟并分泌前炎性因子。另外,該融合蛋白還可有效提高抗原遞呈細(xì)胞(APCs)遞呈EGFP抗原的能力,更為重要的是融合蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗EGFP的T細(xì)胞免疫應(yīng)答,而EGFP單獨(dú)免疫組沒有能夠活化APCs,也沒能誘導(dǎo)產(chǎn)生 T細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)上述結(jié)果Cuadros認(rèn)為,重組鞭毛蛋白融合蛋白可能是適合的載體,作為佐劑或疫苗可用于新型免疫接種策略的開發(fā),從而誘導(dǎo)和加強(qiáng)抗傳染病和癌癥的免疫應(yīng)答。但迄今為止,針對(duì)鞭毛蛋白免疫佐劑效應(yīng)的研究仍限于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,在動(dòng)物疾病方面的類似研究還未見報(bào)導(dǎo)。

為此,本研究利用重疊延伸PCR(overlap PCR)技術(shù),通過(guò)柔性肽將鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白和NDV F蛋白部分基因片段串聯(lián),構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鞭毛蛋白與F蛋白的融合蛋白,并以C3H/HeJ小鼠為動(dòng)物模型,初步探討融合蛋白的免疫原性,以期為新城疫的免疫預(yù)防提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和血清 含有NDV F48E8株全長(zhǎng)F基因的重組質(zhì)粒pVAX1-F、含有鼠傷寒沙門菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliCi的重組質(zhì)粒pET-fliC、原核表達(dá)載體 pET30a+;宿主菌 DH5α、BL21(DE3)均由江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;NDV F蛋白、野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白,小鼠抗NDV F蛋白多抗血清和抗fliC蛋白多抗血清均由江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ,高保真Taq酶,T4 DNA連接酶以及DNA回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Promega公司;酵母抽提物、蛋白胨購(gòu)自 Oxoid公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗購(gòu)自Sigma公司;小牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡～8周齡雌性C3H/HeJ小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 以重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC為模板,設(shè)計(jì)引物FF1和FF2擴(kuò)增fliC基因。上游引物FF1引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分),下游引物FF2引入柔性肽(Gly4Ser)2上游序列(下劃線部分);以重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F為模板,設(shè)計(jì)引物FF3和FF4擴(kuò)增F基因。上游引物FF3引入柔性肽(Gly4Ser)2下游序列(下劃線部分),下游引物FF4引入HindⅢ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)及終止子(黑體表示)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,它們的序列如下所示:

1.2.2 fliC-F基因的擴(kuò)增及克隆 以pET-fliC為模板,用引物FF1、FF2擴(kuò)增fliC基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃50 s,52.1℃55 s,72℃2 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。以pVAX1-F 為模板,用引物FF3、FF4擴(kuò)增F基因部分片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃50 s,52.1℃50 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。再以上述兩種PCR產(chǎn)物為模板,用引物FF1、FF4通過(guò) overlap PCR拼接和擴(kuò)增fliC-F基因片段,預(yù)期片段大小為2 112 bp。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s,68℃55 s,72℃2 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。將擴(kuò)增的fliC-F基因經(jīng)3 mol/L NaAc、無(wú)水乙醇沉淀后回收,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切目的片段以及載體pET30a+后,分別回收目的片段及載體,4℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,以卡那霉素抗性篩選,并經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,選酶切結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-fliC-F。

1.2.3 fliC-F基因的原核表達(dá)及可溶性鑒定

1.2.3.1 重組菌的構(gòu)建 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-fliC-F轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3),經(jīng)卡那霉素抗性篩選后,挑取單個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定,將鑒定正確的重組菌命名為BL21(DE3)(pET-fliC-F)。

1.2.3.2 重組菌表達(dá)及目的蛋白表達(dá)形式的鑒定將 BL21(DE3)(pET-fliC-F)小量接種含50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基,取過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液1∶100擴(kuò)大培養(yǎng),37℃振搖培養(yǎng)至OD600為 0.4～0.5,加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解后離心,取沉淀和上清。將誘導(dǎo)產(chǎn)物、誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的提取及純化

1.2.4.1 包涵體的獲得 將600 mL誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)培養(yǎng)物離心后收集沉淀。無(wú)菌PBS洗滌3次,用變性液(20 mmol/L T ris-HCl,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mol/L尿素,5 mL/L Triton-100,pH 8.0)重懸 ,在冰浴條件下超聲裂解,于4℃以10 000 r/min離心15 min,收集沉淀,即為粗制包涵體。用相同體積的變性液重懸,超聲洗滌 20 min,于 4 ℃以10 000 r/min離心15 min收集沉淀。將包涵體按此步驟重復(fù)洗滌3次。

1.2.4.2 表達(dá)產(chǎn)物的變性復(fù)性 將包涵體溶解于變性緩沖液(6 mol/L鹽酸胍,50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,50 mmol/L DT T,pH 8.5),37℃振搖4 h,12 000 r/min離心25 min,小心吸取上清液,棄去沉淀。在冰浴條件下將上清用復(fù)性緩沖液1(50 mmol/L Tris-HCl,1.5 mol/L尿素,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,50 mL/L甘油,pH 8.0)稀釋;然后用復(fù)性緩沖液2(20 mmol/L T ris-HCl,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,50 mL/L甘油,pH 8.0)透析,每隔12 h換一次透析液,換 3次 ～4次即可。溶液充分透析后用PEG8000濃縮即可獲得復(fù)性蛋白。

1.2.5 Western blot分析 將誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)(pET30a+)和 BL21(DE3)(pET-fliC-F)經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用含100 mL/L小牛血清的PBST 4℃作用12 h;PBST洗滌3次后,將PVDF膜分為兩組,分別以實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠抗F蛋白多抗血清和fliC蛋白多抗血清作為一抗(均以1∶200稀釋)作用1.5 h,充分洗滌后以 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶1 000稀釋)作用1 h,PBST洗滌3次后,DAB顯色,蒸餾水終止反應(yīng),觀察結(jié)果,拍照記錄。

1.2.6 fliC-F融合蛋白的免疫原性檢測(cè)

1.2.6.1 小鼠免疫 6周齡～8周齡雌性C3H/HeJ小鼠分為5組,每組5只,分別為F蛋白免疫組、fliC蛋白免疫組、F蛋白油乳劑免疫組、fliC-F蛋白免疫組和空白對(duì)照組。免疫途徑為皮下注射,免疫分兩次進(jìn)行,首免后間隔10 d進(jìn)行二免,蛋白免疫劑量均為100 μ g/只。F蛋白油乳劑免疫組首免加完全福氏佐劑,二免加不完全福氏佐劑進(jìn)行免疫,空白對(duì)照組以PBS替代。

1.2.6.2 抗體測(cè)定 各免疫組在一免后第10天,二免后第14、21天分別眼眶靜脈采血,收集血清樣品,置-20℃保存?zhèn)溆?。參照潘志明等[7]建立的ELISA 方法,純化的NDV F蛋白每孔2 μ g包被,待檢血清作1∶160稀釋,酶標(biāo)儀測(cè)定OD490值,各試驗(yàn)組OD490值(P)與空白對(duì)照組OD490值(N)的比值(P/N)大于2.1時(shí)判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 fliC-F基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照1.2中PCR擴(kuò)增方法,分別用相應(yīng)模板及引物擴(kuò)增出fliC、F、fliC-F片段,大小分別為1 507、620、2 112 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 fliC、F、fliC-F基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of fliC,F and fliC-F genes

2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC-F的構(gòu)建結(jié)果

分別將fliC-F PCR產(chǎn)物及原核表達(dá)載體pET30a+用EcoR Ⅰ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切,回收后連接,獲得重組質(zhì)粒pET-fliC-F。重組質(zhì)粒再經(jīng)EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切后電泳,出現(xiàn)約2 112 bp的插入片段和5 400 bp的載體片段(圖2),與預(yù)期結(jié)果相符,說(shuō)明fliC-F基因已被正確插入表達(dá)載體pET30a+。序列測(cè)定結(jié)果表明,擴(kuò)增的fliC-F基因沒有發(fā)生堿基突變。

2.3 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的構(gòu)建結(jié)果

將重組質(zhì)粒 pET-fliC-F轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3),篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)(pET-fliC-F),經(jīng)PCR擴(kuò)增出的fliC-F基因片段大小約2 112 bp(圖3),與預(yù)期結(jié)果相符,說(shuō)明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC-F已成功導(dǎo)入宿主菌BL21(DE3)。

2.4 fliC-F基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

挑取重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)單個(gè)克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果表明fliC-F基因在大腸埃希菌中獲得較好表達(dá),融合蛋白大小為79.3 ku,且可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式均存在(圖4)。

2.5 包涵體的分離及變性、復(fù)性結(jié)果

按1.2.4方法對(duì)BL21(DE3)(pET-fliC-F)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行變性、復(fù)性、透析和濃縮后,測(cè)定蛋白含量為1.3 mg/mL,共獲得復(fù)性蛋白9.1 mg。SDSPAGE結(jié)果顯示,雜蛋白較少,純化效果良好(圖5)。

圖2 重組質(zhì)粒pET-fliC-F的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pET-fliC-F by endonuclease digestion

圖3 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of BL21(DE3)(pET-fliC-F)by PCR

圖4 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig.4 Induced expression of recombinant pET-fliC-F in BL21(DE3)

圖5 復(fù)性fliC-F蛋白檢測(cè)Fig.5 Identification of the refolded fliC-F protein

2.6 Western blot分析結(jié)果

Western blot結(jié)果表明,小鼠抗F蛋白或抗fliC蛋白多抗血清均能識(shí)別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌在79.3 ku位置的特異性條帶,這與表達(dá)的融合蛋白fliC-F的大小相符(圖6)。

圖6 Western blot分析fliC-F融合蛋白Fig.6 Western blot analysis of the fusion protein fliC-F

2.7 F蛋白特異性血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

一免后第10天fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組與空白對(duì)照組的OD490值P/N＜2.1,二免后第14、21天二者與空白對(duì)照組的P/N值大于2.1。而F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組在一免后第10天,二免后第14、21天與空白對(duì)照組的P/N值均小于2.1。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組均產(chǎn)生了F蛋白特異性血清抗體(表1)。

表1 F蛋白特異性血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 1 The values of serum antibody against F protein

3 討論

近年,新城疫在全國(guó)范圍內(nèi)的發(fā)生仍然比較普遍,對(duì)于該病的預(yù)防控制主要是使用常規(guī)疫苗,如各種不同毒力的弱毒疫苗和油乳劑滅活疫苗。常規(guī)疫苗效果確實(shí),但也存在一定隱患,如病毒毒力返強(qiáng)和滅活不徹底所帶來(lái)的危害。除了常規(guī)疫苗外,亞單位疫苗也是一個(gè)有效的免疫預(yù)防手段。

鞭毛蛋白作為天然免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然免疫應(yīng)答可幫助建立針對(duì)外源抗原的獲得性免疫應(yīng)答。T LR5配體鞭毛蛋白作為免疫佐劑具有其優(yōu)越性,如鞭毛蛋白對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生超敏反應(yīng);低劑量即能發(fā)揮效應(yīng);活化APCs的功能顯著,并可同時(shí)增強(qiáng)APCs對(duì)外源抗原的攝取、加工和遞呈能力;預(yù)先存在的鞭毛蛋白抗體不會(huì)影響其佐劑活性等。應(yīng)用沙門菌鞭毛蛋白與耶爾森菌、西尼羅病毒、單核增生李斯特菌、流感病毒、瘧原蟲等保護(hù)性抗原或表位構(gòu)成的融合蛋白,以注射或黏膜途徑免疫接種小鼠,小鼠均產(chǎn)生了顯著的全身性免疫應(yīng)答,并提供強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)[8-13]。

在前期的研究中,我們已經(jīng)證實(shí)了NDV F部分蛋白的免疫原性[14]。在此基礎(chǔ)上,本文利用鞭毛蛋白的免疫佐劑效應(yīng)的特點(diǎn),融合表達(dá)鞭毛蛋白與F蛋白基因,以鞭毛蛋白作為佐劑,觀察機(jī)體激發(fā)產(chǎn)生針對(duì)F蛋白特異性的免疫應(yīng)答。

在本試驗(yàn)中,為了保證鞭毛蛋白與F蛋白在融合表達(dá)后可以獨(dú)立折疊,形成互不干擾的空間結(jié)構(gòu),我們?cè)O(shè)計(jì)引物,通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)將二者基因片段通過(guò)一段氨基酸序列為GGGGSGGGGS的linker串聯(lián)起來(lái),插入原核表達(dá)載體pET30a+中,利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了表達(dá)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠抗F蛋白或fliC蛋白多抗血清均能特異性識(shí)別該表達(dá)產(chǎn)物,證實(shí)了二者能基本獨(dú)立地形成各自的天然結(jié)構(gòu)。

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組二免后第14、21天與空白對(duì)照組在血清稀釋度為1∶160時(shí),OD490值P/N＞2.1,而F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組的P/N值則小于2.1。由此可以推斷,本試驗(yàn)原核表達(dá)的fliC-F蛋白能夠發(fā)揮fliC蛋白的免疫佐劑活性,刺激C3H/HeJ小鼠產(chǎn)生針對(duì)F蛋白的特異性血清抗體。

本研究建立了 fliC-F融合蛋白的原核表達(dá)體系,并對(duì)表達(dá)蛋白的免疫原性做了初步的探索,表明該融合蛋白具有良好的免疫原性,下一步將探討該融合蛋白對(duì)雞NDV強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)力,以期為新城疫疫苗的研究提供新思路。

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Coexpression of flic Protein ofSalmonella typhimuriumand F Protein of NDV and Its Immunogenicity Analysis in Mice

YOU Meng,PAN Zhi-ming,GENG Shi-zhong,MA Quan-gang,FANG Qiang,JIAO Xin-an

(J iangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Y angzhou,J iangsu,225009,China)

The fliC gene ofSalmonella ty phimuriumand the partial fragment of fusion protein(F)gene of Newcastle disease virus were amplified using PCR and ligated with a DNA sequence encoding a flexible peptide(Gly4Ser)2.The fusion gene was inserted into plasmid pET30a+to construct the recombinant prokaryotic expression plasmid pET-fliC-F.Then the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21(DE3)and induced to express the desired fliC-F protein.Western blot analysis showed that the fliC-F protein could react with murinal antiserum against fliC or F protein,respectively.It indicated that the fusion protein could significantly elicit specific immune response in immunized C3H/HeJ mice.These results demonstrated that the fliC-F fusion protein expressed byE.colihad good immunogenicity.

Salmonella typhimurium;fliC protein;Newcastle disease virus;fusion protein;immunogenicity

S852.659.5;S852.612

A

1007-5038(2010)02-0020-06

2009-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30871860);高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新工程重大項(xiàng)目(706032);江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2007511,BK2008011);江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(07KJB230136);江蘇省高校“青藍(lán)工程”項(xiàng)目

游 猛(1985-),男,江蘇姜堰人,碩士研究生,主要從事細(xì)胞與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者