游 猛,潘志明,耿士忠,馬全剛,方 強,焦新安

(揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇揚州 225009)

鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與新城疫病毒F蛋白的融合表達及免疫原性分析*

游 猛,潘志明*,耿士忠,馬全剛,方 強,焦新安*

(揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇揚州 225009)

應用PCR技術分別擴增鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通過柔性肽(Gly4Ser)2編碼序列將二者串聯(lián)并克隆到質(zhì)粒pET30a+上,獲得重組原核表達質(zhì)粒pET-fliC-F,將其轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)中表達。Western blot證實重組菌表達的fliC-F融合蛋白能與小鼠抗fliC和抗F蛋白兩種多抗血清發(fā)生特異性反應。動物試驗顯示,fliC-F融合蛋白能夠刺激C3H/HeJ小鼠產(chǎn)生針對F蛋白的特異性血清抗體,說明原核表達系統(tǒng)表達的fliC-F融合蛋白具有較好的免疫原性。

鼠傷寒沙門菌;鞭毛蛋白;新城疫病毒;融合蛋白;免疫原性

新城疫(Newcastle disease,ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)確定為法定報告疾病,免疫預防是控制該病的重要手段。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的融合蛋白(F)除了參與病毒的穿透、細胞融合,與病毒的致病性有關外,還具有良好的免疫原性,是NDV亞單位疫苗研究的主要目的抗原[1]。

Janeway C A[2]首次提出,機體對外來抗原物質(zhì)如對病原微生物的識別是由細胞的特定受體介導的。目前已證實,這一識別主要是通過細胞表面的Toll樣受體(T oll-like receptor,TLRs)家族分子來實現(xiàn)的。T LRs可識別病原微生物高度保守的結(jié)構(gòu)基序,即所謂的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并誘導產(chǎn)生天然免疫應答[3]。特定的 TLRs可以識別相應的PAMPs,其中T LR5識別鞭毛蛋白[4]。鞭毛蛋白作為天然免疫應答的誘導劑,誘導產(chǎn)生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答,從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的效應[5]。Cuadros C等[6]利用原核表達系統(tǒng)表達鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的融合蛋白作用骨髓源抗原遞呈細胞(BMDCs),可刺激BMDCs成熟并分泌前炎性因子。另外,該融合蛋白還可有效提高抗原遞呈細胞(APCs)遞呈EGFP抗原的能力,更為重要的是融合蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗EGFP的T細胞免疫應答,而EGFP單獨免疫組沒有能夠活化APCs,也沒能誘導產(chǎn)生 T細胞免疫應答。根據(jù)上述結(jié)果Cuadros認為,重組鞭毛蛋白融合蛋白可能是適合的載體,作為佐劑或疫苗可用于新型免疫接種策略的開發(fā),從而誘導和加強抗傳染病和癌癥的免疫應答。但迄今為止,針對鞭毛蛋白免疫佐劑效應的研究仍限于醫(yī)學領域,在動物疾病方面的類似研究還未見報導。

為此,本研究利用重疊延伸PCR(overlap PCR)技術,通過柔性肽將鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白和NDV F蛋白部分基因片段串聯(lián),構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒,利用原核表達系統(tǒng)表達鞭毛蛋白與F蛋白的融合蛋白,并以C3H/HeJ小鼠為動物模型,初步探討融合蛋白的免疫原性,以期為新城疫的免疫預防提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和血清 含有NDV F48E8株全長F基因的重組質(zhì)粒pVAX1-F、含有鼠傷寒沙門菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliCi的重組質(zhì)粒pET-fliC、原核表達載體 pET30a+;宿主菌 DH5α、BL21(DE3)均由江蘇省人獸共患病學重點實驗室保存;NDV F蛋白、野生型鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白,小鼠抗NDV F蛋白多抗血清和抗fliC蛋白多抗血清均由江蘇省人獸共患病學重點實驗室自制。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ,高保真Taq酶,T4 DNA連接酶以及DNA回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自Promega公司;酵母抽提物、蛋白胨購自 Oxoid公司;HRP標記的羊抗鼠IgG酶標二抗購自Sigma公司;小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗動物 6周齡～8周齡雌性C3H/HeJ小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 以重組原核表達質(zhì)粒pET-fliC為模板,設計引物FF1和FF2擴增fliC基因。上游引物FF1引入EcoRⅠ酶切位點(下劃線部分),下游引物FF2引入柔性肽(Gly4Ser)2上游序列(下劃線部分);以重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-F為模板,設計引物FF3和FF4擴增F基因。上游引物FF3引入柔性肽(Gly4Ser)2下游序列(下劃線部分),下游引物FF4引入HindⅢ酶切位點(下劃線部分)及終止子(黑體表示)。引物由上海英駿生物技術有限公司合成,它們的序列如下所示:

1.2.2 fliC-F基因的擴增及克隆 以pET-fliC為模板,用引物FF1、FF2擴增fliC基因。PCR反應程序為:94℃預變性5 min;94℃50 s,52.1℃55 s,72℃2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。以pVAX1-F 為模板,用引物FF3、FF4擴增F基因部分片段。PCR反應程序為:94℃預變性5 min;94℃50 s,52.1℃50 s,72℃1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。再以上述兩種PCR產(chǎn)物為模板,用引物FF1、FF4通過 overlap PCR拼接和擴增fliC-F基因片段,預期片段大小為2 112 bp。PCR反應程序為:94℃預變性5 min;94℃30 s,68℃55 s,72℃2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃10 min。將擴增的fliC-F基因經(jīng)3 mol/L NaAc、無水乙醇沉淀后回收,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切目的片段以及載體pET30a+后,分別回收目的片段及載體,4℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,以卡那霉素抗性篩選,并經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,選酶切結(jié)果與預期相符的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定,測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-fliC-F。

1.2.3 fliC-F基因的原核表達及可溶性鑒定

1.2.3.1 重組菌的構(gòu)建 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-fliC-F轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3),經(jīng)卡那霉素抗性篩選后,挑取單個克隆進行PCR鑒定,將鑒定正確的重組菌命名為BL21(DE3)(pET-fliC-F)。

1.2.3.2 重組菌表達及目的蛋白表達形式的鑒定將 BL21(DE3)(pET-fliC-F)小量接種含50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基,取過夜培養(yǎng)的新鮮菌液1∶100擴大培養(yǎng),37℃振搖培養(yǎng)至OD600為 0.4～0.5,加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG進行誘導表達。誘導產(chǎn)物裂解后離心,取沉淀和上清。將誘導產(chǎn)物、誘導產(chǎn)物裂解沉淀和上清進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 表達產(chǎn)物的提取及純化

1.2.4.1 包涵體的獲得 將600 mL誘導表達的重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)培養(yǎng)物離心后收集沉淀。無菌PBS洗滌3次,用變性液(20 mmol/L T ris-HCl,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mol/L尿素,5 mL/L Triton-100,pH 8.0)重懸 ,在冰浴條件下超聲裂解,于4℃以10 000 r/min離心15 min,收集沉淀,即為粗制包涵體。用相同體積的變性液重懸,超聲洗滌 20 min,于 4 ℃以10 000 r/min離心15 min收集沉淀。將包涵體按此步驟重復洗滌3次。

1.2.4.2 表達產(chǎn)物的變性復性 將包涵體溶解于變性緩沖液(6 mol/L鹽酸胍,50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,50 mmol/L DT T,pH 8.5),37℃振搖4 h,12 000 r/min離心25 min,小心吸取上清液,棄去沉淀。在冰浴條件下將上清用復性緩沖液1(50 mmol/L Tris-HCl,1.5 mol/L尿素,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,50 mL/L甘油,pH 8.0)稀釋;然后用復性緩沖液2(20 mmol/L T ris-HCl,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,50 mL/L甘油,pH 8.0)透析,每隔12 h換一次透析液,換 3次 ～4次即可。溶液充分透析后用PEG8000濃縮即可獲得復性蛋白。

1.2.5 Western blot分析 將誘導表達的BL21(DE3)(pET30a+)和 BL21(DE3)(pET-fliC-F)經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用含100 mL/L小牛血清的PBST 4℃作用12 h;PBST洗滌3次后,將PVDF膜分為兩組,分別以實驗室自制的小鼠抗F蛋白多抗血清和fliC蛋白多抗血清作為一抗(均以1∶200稀釋)作用1.5 h,充分洗滌后以 HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶1 000稀釋)作用1 h,PBST洗滌3次后,DAB顯色,蒸餾水終止反應,觀察結(jié)果,拍照記錄。

1.2.6 fliC-F融合蛋白的免疫原性檢測

1.2.6.1 小鼠免疫 6周齡～8周齡雌性C3H/HeJ小鼠分為5組,每組5只,分別為F蛋白免疫組、fliC蛋白免疫組、F蛋白油乳劑免疫組、fliC-F蛋白免疫組和空白對照組。免疫途徑為皮下注射,免疫分兩次進行,首免后間隔10 d進行二免,蛋白免疫劑量均為100 μ g/只。F蛋白油乳劑免疫組首免加完全福氏佐劑,二免加不完全福氏佐劑進行免疫,空白對照組以PBS替代。

1.2.6.2 抗體測定 各免疫組在一免后第10天,二免后第14、21天分別眼眶靜脈采血,收集血清樣品,置-20℃保存?zhèn)溆?。參照潘志明等[7]建立的ELISA 方法,純化的NDV F蛋白每孔2 μ g包被,待檢血清作1∶160稀釋,酶標儀測定OD490值,各試驗組OD490值(P)與空白對照組OD490值(N)的比值(P/N)大于2.1時判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 fliC-F基因的PCR擴增結(jié)果

按照1.2中PCR擴增方法,分別用相應模板及引物擴增出fliC、F、fliC-F片段,大小分別為1 507、620、2 112 bp,與預期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 fliC、F、fliC-F基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of fliC,F and fliC-F genes

2.2 重組原核表達質(zhì)粒pET-fliC-F的構(gòu)建結(jié)果

分別將fliC-F PCR產(chǎn)物及原核表達載體pET30a+用EcoR Ⅰ和HindⅢ進行雙酶切,回收后連接,獲得重組質(zhì)粒pET-fliC-F。重組質(zhì)粒再經(jīng)EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切后電泳,出現(xiàn)約2 112 bp的插入片段和5 400 bp的載體片段(圖2),與預期結(jié)果相符,說明fliC-F基因已被正確插入表達載體pET30a+。序列測定結(jié)果表明,擴增的fliC-F基因沒有發(fā)生堿基突變。

2.3 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的構(gòu)建結(jié)果

將重組質(zhì)粒 pET-fliC-F轉(zhuǎn)化表達菌BL21(DE3),篩選的陽性轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)(pET-fliC-F),經(jīng)PCR擴增出的fliC-F基因片段大小約2 112 bp(圖3),與預期結(jié)果相符,說明重組原核表達質(zhì)粒pET-fliC-F已成功導入宿主菌BL21(DE3)。

2.4 fliC-F基因表達產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

挑取重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)單個克隆經(jīng)IPTG誘導表達,誘導產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果表明fliC-F基因在大腸埃希菌中獲得較好表達,融合蛋白大小為79.3 ku,且可溶性和包涵體兩種表達形式均存在(圖4)。

2.5 包涵體的分離及變性、復性結(jié)果

按1.2.4方法對BL21(DE3)(pET-fliC-F)表達產(chǎn)物進行變性、復性、透析和濃縮后,測定蛋白含量為1.3 mg/mL,共獲得復性蛋白9.1 mg。SDSPAGE結(jié)果顯示,雜蛋白較少,純化效果良好(圖5)。

圖2 重組質(zhì)粒pET-fliC-F的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pET-fliC-F by endonuclease digestion

圖3 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of BL21(DE3)(pET-fliC-F)by PCR

圖4 重組菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)的誘導表達分析Fig.4 Induced expression of recombinant pET-fliC-F in BL21(DE3)

圖5 復性fliC-F蛋白檢測Fig.5 Identification of the refolded fliC-F protein

2.6 Western blot分析結(jié)果

Western blot結(jié)果表明,小鼠抗F蛋白或抗fliC蛋白多抗血清均能識別經(jīng)IPTG誘導表達的重組菌在79.3 ku位置的特異性條帶,這與表達的融合蛋白fliC-F的大小相符(圖6)。

圖6 Western blot分析fliC-F融合蛋白Fig.6 Western blot analysis of the fusion protein fliC-F

2.7 F蛋白特異性血清抗體效價測定結(jié)果

一免后第10天fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組與空白對照組的OD490值P/N＜2.1,二免后第14、21天二者與空白對照組的P/N值大于2.1。而F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組在一免后第10天,二免后第14、21天與空白對照組的P/N值均小于2.1。試驗數(shù)據(jù)表明,fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組均產(chǎn)生了F蛋白特異性血清抗體(表1)。

表1 F蛋白特異性血清抗體效價測定結(jié)果Table 1 The values of serum antibody against F protein

3 討論

近年,新城疫在全國范圍內(nèi)的發(fā)生仍然比較普遍,對于該病的預防控制主要是使用常規(guī)疫苗,如各種不同毒力的弱毒疫苗和油乳劑滅活疫苗。常規(guī)疫苗效果確實,但也存在一定隱患,如病毒毒力返強和滅活不徹底所帶來的危害。除了常規(guī)疫苗外,亞單位疫苗也是一個有效的免疫預防手段。

鞭毛蛋白作為天然免疫應答的誘導劑,誘導產(chǎn)生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答。T LR5配體鞭毛蛋白作為免疫佐劑具有其優(yōu)越性,如鞭毛蛋白對宿主不會產(chǎn)生超敏反應;低劑量即能發(fā)揮效應;活化APCs的功能顯著,并可同時增強APCs對外源抗原的攝取、加工和遞呈能力;預先存在的鞭毛蛋白抗體不會影響其佐劑活性等。應用沙門菌鞭毛蛋白與耶爾森菌、西尼羅病毒、單核增生李斯特菌、流感病毒、瘧原蟲等保護性抗原或表位構(gòu)成的融合蛋白,以注射或黏膜途徑免疫接種小鼠,小鼠均產(chǎn)生了顯著的全身性免疫應答,并提供強毒攻擊的免疫保護[8-13]。

在前期的研究中,我們已經(jīng)證實了NDV F部分蛋白的免疫原性[14]。在此基礎上,本文利用鞭毛蛋白的免疫佐劑效應的特點,融合表達鞭毛蛋白與F蛋白基因,以鞭毛蛋白作為佐劑,觀察機體激發(fā)產(chǎn)生針對F蛋白特異性的免疫應答。

在本試驗中,為了保證鞭毛蛋白與F蛋白在融合表達后可以獨立折疊,形成互不干擾的空間結(jié)構(gòu),我們設計引物,通過重疊延伸PCR技術將二者基因片段通過一段氨基酸序列為GGGGSGGGGS的linker串聯(lián)起來,插入原核表達載體pET30a+中,利用原核表達系統(tǒng)成功獲得了表達。Western blot試驗結(jié)果表明,小鼠抗F蛋白或fliC蛋白多抗血清均能特異性識別該表達產(chǎn)物,證實了二者能基本獨立地形成各自的天然結(jié)構(gòu)。

動物試驗結(jié)果顯示,fliC-F蛋白免疫組和F蛋白油乳劑免疫組二免后第14、21天與空白對照組在血清稀釋度為1∶160時,OD490值P/N＞2.1,而F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組的P/N值則小于2.1。由此可以推斷,本試驗原核表達的fliC-F蛋白能夠發(fā)揮fliC蛋白的免疫佐劑活性,刺激C3H/HeJ小鼠產(chǎn)生針對F蛋白的特異性血清抗體。

本研究建立了 fliC-F融合蛋白的原核表達體系,并對表達蛋白的免疫原性做了初步的探索,表明該融合蛋白具有良好的免疫原性,下一步將探討該融合蛋白對雞NDV強毒攻擊的免疫保護力,以期為新城疫疫苗的研究提供新思路。

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Coexpression of flic Protein ofSalmonella typhimuriumand F Protein of NDV and Its Immunogenicity Analysis in Mice

YOU Meng,PAN Zhi-ming,GENG Shi-zhong,MA Quan-gang,FANG Qiang,JIAO Xin-an

(J iangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Y angzhou,J iangsu,225009,China)

The fliC gene ofSalmonella ty phimuriumand the partial fragment of fusion protein(F)gene of Newcastle disease virus were amplified using PCR and ligated with a DNA sequence encoding a flexible peptide(Gly4Ser)2.The fusion gene was inserted into plasmid pET30a+to construct the recombinant prokaryotic expression plasmid pET-fliC-F.Then the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21(DE3)and induced to express the desired fliC-F protein.Western blot analysis showed that the fliC-F protein could react with murinal antiserum against fliC or F protein,respectively.It indicated that the fusion protein could significantly elicit specific immune response in immunized C3H/HeJ mice.These results demonstrated that the fliC-F fusion protein expressed byE.colihad good immunogenicity.

Salmonella typhimurium;fliC protein;Newcastle disease virus;fusion protein;immunogenicity

S852.659.5;S852.612

A

1007-5038(2010)02-0020-06

2009-09-15

國家自然科學基金資助項目(30871860);高等學校科技創(chuàng)新工程重大項目(706032);江蘇省自然科學基金項目(BK2007511,BK2008011);江蘇省高校自然科學基礎研究項目(07KJB230136);江蘇省高?！扒嗨{工程”項目

游 猛(1985-),男,江蘇姜堰人,碩士研究生,主要從事細胞與分子免疫學研究。*通訊作者