龐耀珊,謝芝勛,黃 琦,謝麗基,鄧顯文,謝志勤,劉加波

(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001;2.廣西南寧市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局,廣西南寧 530028)

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬圓環(huán)病毒2型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立*

龐耀珊1,謝芝勛1,黃 琦2,謝麗基1,鄧顯文1,謝志勤1,劉加波1

(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001;2.廣西南寧市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局,廣西南寧 530028)

以胸膜肺炎放線桿菌(App)apxⅣA基因和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2基因?yàn)榘谢?分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立App和PCV-2的二重?zé)晒釶CR方法。App引物擴(kuò)增的目的片段大小為132 bp,PCV-2為169 bp。建立的方法可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)App和PCV-2進(jìn)行定量檢測(cè)鑒別,其敏感性分別為1×101拷貝和1×100拷貝,對(duì)其他豬病病原核酸的檢測(cè)為陰性。利用該方法對(duì)10份人工感染臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn),其結(jié)果符合率達(dá)100%,說(shuō)明該方法可用于對(duì)臨床樣品中App和PCV-2的檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光PCR;胸膜肺炎放線桿菌;豬圓環(huán)病毒2型

豬傳染性胸膜肺炎(Infectious pleuropneumonia of swine,IPPS)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染是豬的兩種主要呼吸道疾病。近年來(lái)隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,這兩種疾病在我國(guó)呈上升趨勢(shì),并成為當(dāng)前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的疾病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。IPPS由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)引起,以急性出血和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征,是一種高度致死性傳染性呼吸道疾病。App可存在于健康豬的扁桃體、鼻腔、氣管中,成為主要的傳染源,或在豬群抵抗力下降時(shí)迅速增殖,導(dǎo)致疫病暴發(fā)[5]。PCV-2是新發(fā)現(xiàn)的一種免疫抑制性病毒,侵害豬的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致其抵抗力下降而容易誘發(fā)其他疾病。該病同時(shí)也是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,患病豬呼吸困難、貧血,出現(xiàn)明顯的淋巴組織病變和漸進(jìn)性消瘦[5]。IPPS和PMWS臨床癥狀相似,均主要侵害6周齡～12周齡的斷奶仔豬。病豬表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦、黃疸和呼吸困難,剖檢可見(jiàn)淋巴結(jié)腫大,間質(zhì)性肺炎,肺部彌漫性充血,腎臟蒼白等癥狀。臨床上這兩種病原混合感染現(xiàn)象十分普遍[6-7],常規(guī)方法難以鑒別診斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種融PCR和DNA探針雜交技術(shù)為一體的基因體外擴(kuò)增技術(shù),它通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物熒光信號(hào)的變化而達(dá)到檢測(cè)病原核酸的目的,該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法。另外,該技術(shù)還可以根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接從檢測(cè)到的熒光閾值推算樣品中相應(yīng)病原的含量。在臨床檢測(cè)和對(duì)疾病進(jìn)程的評(píng)價(jià)上具有很高的實(shí)用價(jià)值[8-9]。

本研究根據(jù) App apxⅣA毒素基因和PCV-2 ORF2基因的保守序列,分別設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光標(biāo)記探針,建立了可同時(shí)檢測(cè)App和PCV-2的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

App血清1型～10型(5型除外)國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,血清5型分離株為北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所陳小玲研究員惠贈(zèng);PCV-2標(biāo)準(zhǔn)毒其他豬源致病菌和病毒的毒株、臨床樣品均由廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的App序列(AF188867)和PCV-2序列(EF210106),分別針對(duì)App的apxⅣA基因和PCV-2的ORF2基因設(shè)計(jì)引物和探針,如表1所示。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 App和PCV-2的特異性引物和熒光標(biāo)記探針Table 1 Specific primers and fluorescence-labeled probes of App and PCV-2

1.2.2 App apxⅣA和PCV-2 ORF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 App菌株涂布接種于添加1 g/L NAD和50 mL/L馬血清的PPLO平板上,在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下37℃培養(yǎng)24 h,用滅菌水洗下平板上的菌落,離心收集細(xì)菌。分別按文獻(xiàn)[10-11]方法提取App和PCV-2的DNA作為模板。通過(guò)PCR擴(kuò)增,得到App apxⅣA基因的132 bp DNA片段和PCV-2 ORF2基因的169 bp DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收純化后,連接到pMD-18T載體,分別構(gòu)建App apxⅣA和 PCV-2 ORF2重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序等鑒定,得到陽(yáng)性重組質(zhì)檢。利用DNA小量快速抽提試劑盒抽提陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD260和OD280,計(jì)算濃度,同時(shí)按10倍系列稀釋備用。

1.2.3 二重實(shí)時(shí)熒光PCR的優(yōu)化建立

1.2.3.1 引物和探針用量的優(yōu)化 采用20 μ L反應(yīng)體系,其中 2×Premix ExTaqTM10 μ L,App 和PCV-2 上 、下游引物各 0.5 μ L,DNA 模板 5 μ L,超純水 3.4 μ L,App 探針 和 PCV-2 探 針各 0.3 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?95℃20 s,95℃5 s、60℃25 s循環(huán)40次。在 Lightcycler 2.0 Real-time PCR儀(Roche公司)上,應(yīng)用App和PCV-2陽(yáng)性質(zhì)粒DNA混合物為模板,對(duì)App和PCV-2的引物、探針等進(jìn)行不同濃度的方陣試驗(yàn),篩選出能同時(shí)擴(kuò)增 App和PCV-2,且對(duì)Ct值和擴(kuò)增效率影響不大的使用量。

1.2.3.2 顏色補(bǔ)償試驗(yàn) 利用經(jīng)1.2.3.1優(yōu)化后的App、PCV-2引物和探針濃度,分別對(duì) 530、610熒光通道進(jìn)行顏色補(bǔ)償試驗(yàn),并以water通道為空白對(duì)照。在反應(yīng)進(jìn)行至40個(gè)循環(huán)后加一個(gè)顏色補(bǔ)償程序,連續(xù)收集熒光值,保存試驗(yàn)結(jié)果備用。

1.2.3.3 App和PCV-2二重?zé)晒釶CR的建立

利用經(jīng)1.2.3.1優(yōu)化后的App、PCV-2引物和探針濃度,應(yīng)用相同的反應(yīng)程序,對(duì)10倍系列稀釋的App、PCV-2 DNA混合物模板進(jìn)行擴(kuò)增,單點(diǎn)收集熒光數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后,利用儀器自帶軟件(Light-CyclerSoftware 4.05)加載1.2.3.2的顏色補(bǔ)償試驗(yàn)數(shù)值,分析所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程,建立App和PCV-2二重?zé)晒釶CR。

1.2.4 二重?zé)晒釶CR技術(shù)特性分析

1.2.4.1 特異性試驗(yàn) 以國(guó)內(nèi)10個(gè)血清型的App菌株、1個(gè)PCV-2毒株以及其他對(duì)照常見(jiàn)豬病原,如豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌等為對(duì)照供試材料,制備核酸模板進(jìn)行熒光PCR。其中細(xì)菌病原模板通過(guò)熱裂解法制備,即適量的菌液煮沸5 min后,4 000 r/min離心2 min,取上清作為反應(yīng)模板。DNA病毒則利用酚/氯仿抽提,RNA病毒用Trizol抽提。將所制備的病原模板加入到二重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系,按1.2.3.3中的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)以超純水作空白對(duì)照,測(cè)定本方法特異性。

1.2.4.2 敏感性試驗(yàn) 將同時(shí)含有等量濃度的App和 PCV-2 DNA 混合物,從 2×107拷貝/μ L開(kāi)始進(jìn)行10倍系列稀釋至2×10-1拷貝/μ L,分別取1 μ L各濃度梯度稀釋液作模板,按1.2.3.3中的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)定本技術(shù)的敏感性。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)濃度分別為2×104、2×103、2×102拷貝/μ L,同時(shí)含有 App和 PCV-2兩種病原的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。對(duì)所有反應(yīng)的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)價(jià)本技術(shù)的穩(wěn)定性。

1.2.4.4 干擾性試驗(yàn) 將App和PCV-2兩種陽(yáng)性質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品按 10倍系列稀釋至 2×107拷貝/μ L,并組合成不同的濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)兩種模板濃度相差較大時(shí)是否存在干擾現(xiàn)象。

1.2.5 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn) 10份分別從人工感染試驗(yàn)豬采集的組織樣品,其中2份為App感染材料,2份為 PCV-2感染材料,2份分別為不同App和PCV-2感染材料的混合物,4份為健康對(duì)照組織樣品。利用1.2.2方法抽提樣品核酸作為模板,對(duì)本研究所建立的二重?zé)晒釶CR方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 App apxⅣA和PCV-2 ORF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用針對(duì)App apxⅣA和PCV-2 ORF2所設(shè)計(jì)的特異性引物,分別對(duì)App 259和PCV-2 DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,將所得到 App 132 bp和PCV-2 169 bp的目的片段分別與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,該重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定以及序列測(cè)定,結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)一致(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR amplification fo r recombinant plasmids

2.2 二重?zé)晒釶CR的建立

不同濃度的App、PCV-2引物和探針的方陣試驗(yàn)結(jié)果為在20 μ L的反應(yīng)體系中,App和PCV-2的上 、下游引物最佳用量分別為 10 μ mol/L 0.4 μ L,探針?lè)謩e為 5 μ mol/L 0.4 μ L。同時(shí),對(duì) 530 和 610熒光通道進(jìn)行顏色補(bǔ)償。利用上述條件,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程,對(duì)不同濃度的App和PCV-2混合DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果App標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒DNA 模板在101拷貝/μ L～107拷貝/μ L之間擴(kuò)增結(jié)果有很好的線性關(guān)系,擴(kuò)增效率為1.864,標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.059 2;PCV-2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒DNA模板則在100拷貝/μ L～107拷貝/μ L之間有很好的線性關(guān)系,擴(kuò)增效率為1.825,標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.098 8。

2.3 二重?zé)晒釶CR技術(shù)特性分析結(jié)果

2.3.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)熒光PCR擴(kuò)增,10個(gè)血清型App菌株均能收集到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)并出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,而對(duì)照病原和空白對(duì)照均收集不到熒光信號(hào),也無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。

2.3.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 App的陽(yáng)性質(zhì)粒最低檢出限量為10個(gè)拷貝,PCV-2的陽(yáng)性質(zhì)粒最低檢出限量為1個(gè)拷貝。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)2×104、2×103、2×102拷貝/μ L不同濃度的App和PCV-2的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)對(duì)所得到的Ct值、算術(shù)平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)等參數(shù)的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ct值的變異系數(shù)均小于5%,差異不顯著(表2)。

表2 二重實(shí)時(shí)定量PCR穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of stability test of duplex real-time PCR

2.3.4 干擾性試驗(yàn)結(jié)果 將App和PCV-2兩種陽(yáng)性質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品按不同濃度組合,經(jīng)熒光PCR擴(kuò)增,各濃度組合均得到相應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用建立的二重?zé)晒釶CR方法,對(duì)供試的10份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果該方法僅對(duì)其中含有App或PCV-2以及同時(shí)含有App和PCV-2的陽(yáng)性樣品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,而對(duì)那些含其他病原的陰性樣品無(wú)擴(kuò)增,符合率100%。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種融合了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)在密閉系統(tǒng)中自動(dòng)、實(shí)時(shí)地收集熒光信號(hào)來(lái)探測(cè)DNA模板擴(kuò)增量的變化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原核酸的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)以及定性、定量分析,避免了在檢測(cè)過(guò)程中的人為污染。該技術(shù)具有特異性好、敏感性高、重復(fù)性好、干擾性低等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。

App和PCV-2是兩種當(dāng)前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的豬病,臨床上混合感染現(xiàn)象十分普遍。傳統(tǒng)方法對(duì)這兩種疾病進(jìn)行診斷時(shí),操作繁瑣復(fù)雜,特異性和敏感性較低,往往由于技術(shù)本身的局限性難以得出準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。特別是混合感染病例,更加難以鑒別確診。常規(guī)PCR[10]和套式PCR[12]雖具有較高的特異性和敏感性,但其耗時(shí)數(shù)小時(shí),并且一次只能檢測(cè)一種病原。而多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)一次操作就可以同時(shí)檢測(cè)鑒別App和PCV-2兩種病原,并可以在檢測(cè)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。與傳統(tǒng)方法和常規(guī)PCR、套式PCR相比,其在檢測(cè)速度、特異性和敏感性以及定量分析方面具有這些方法所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì),在臨床上有很高的應(yīng)用價(jià)值。

在二重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中,不同引物和探針之間往往會(huì)相互干擾而影響模板的擴(kuò)增。為了最大限度地降低這種干擾,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同濃度引物和探針的方陣試驗(yàn)和顏色補(bǔ)償試驗(yàn)。通過(guò)試驗(yàn),得到App和PCV-2的上、下游引物最佳用量分別為 10 μ mol/L 0.4 μ L,探 針 分 別 為 5 μ mol/L 0.4 μ L,并對(duì)兩種探針(FAM 和ROX)在530和610通道進(jìn)行了顏色補(bǔ)償。經(jīng)顏色補(bǔ)償后,App和PCV-2的擴(kuò)增效率分別為1.864和1.825,標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為0.059 2和0.098 8,各組數(shù)值之間差異不大,表明App和PCV-2均得到了很好的擴(kuò)增。

建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR特性試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)所有供試App和PCV-2均能收集到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)并出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,而對(duì)照病原無(wú)熒光信號(hào),也不出現(xiàn)擴(kuò)增曲線;其對(duì)App的最低檢出量為10拷貝,PCV-2為 1拷貝;對(duì)不同濃度及不同濃度組合的App和PCV-2進(jìn)行檢測(cè),其變異系數(shù)差異不顯著,兩種模板均能得到良好的擴(kuò)增。這些結(jié)果表明,本方法具有很強(qiáng)的特異性、敏感性和穩(wěn)定性,可以用于對(duì)App和PCV-2的鑒別檢測(cè)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果還表明,即使在病原含量較低的感染初期,或App和PCV-2兩種病原感染量差異較大的臨床混合感染樣品,以及經(jīng)某些方法如福爾馬林固定、石蠟包埋等處理后,病原含量較低的感染組織,本技術(shù)同樣適用,不受影響。

本技術(shù)對(duì)10份分別或同時(shí)含有App和PCV-2的臨床陽(yáng)性樣品及其他病原的陰性樣品進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果符合率達(dá)100%。說(shuō)明本Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果可靠,可以作為一種臨床診斷工具對(duì)這兩種疾病病原直接進(jìn)行檢測(cè)。

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Development of a Duplex Real-time FQ-PCR for Detection ofActinobacillus pleuropneumoniaeand Porcine Circovirus Type 2

PANG Yao-shan1,XIE Zhi-xun1,HUANG Qi2,XIE Li-ji1,DENG Xian-wen1,XIE Zhi-qin1,LIU Jia-bo1

(1.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning,Guangxi,530001,China;2.Guangxi Fisheries,Husbandry&Veterinary Bureau,Nanning,Guangxi,530028,China)

A real-time PCR,based onTaqman hybridization probe technology,was developed and applied to detectAnctinobacillus pleuropneumoniae(App)and Porcine circovirus type 2(PCV-2).Two pairs of specific primers and two probes labeled were designed for specific amplification of App apxⅣA and PCV-2 ORF2 genes.The two amplified DNA specific fragments,132 bp for App and 169 bp for PCV-2 ORF2 genes were cloned into pMD-18T plasmid and transformed intoE.coliDH5α.The sensitivity of real time PCR for App and PCV-2 were 1×101copies and 1×100copies,respectively.The assay was specific for App and PCV-2,and reaction to other organisms was negative.10 experimental infection clinical samples were subjected to this real-time PCR.The results were matched to the experiment infection.It suggested that this real-time PCR can be used to detect the pathogens of App and PCV-2 in clinical samples.

real-time FQ-PCR;Actinobacillus pleuropneumoniae;Porcine circovirus type 2

S852.619

A

1007-5038(2010)02-0011-04

2009-08-21

廣西區(qū)水產(chǎn)畜牧局科研計(jì)劃項(xiàng)目(桂漁牧科061910、061909和072412);廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻0537008-3B和0322004-2A);新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程國(guó)家級(jí)人選專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(945200603)

龐耀珊(1967-),女,廣西玉林人,研究員,主要從事動(dòng)物疾病防治研究。