劉愛紅,關(guān)貴全,劉軍龍,李有全,馬米玲,牛慶麗,任巧云,殷 宏,羅建勛

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點實驗室,甘肅蘭州 730046)

呂氏泰勒蟲主要表面蛋白P32基因的克隆與序列分析*

劉愛紅,關(guān)貴全,劉軍龍,李有全,馬米玲,牛慶麗,任巧云,殷 宏*,羅建勛*

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點實驗室,甘肅蘭州 730046)

從呂氏泰勒蟲寧縣株中提取RNA,用RT-PCR方法擴增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后測定其核苷酸序列,并推導了相應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)果表明,擴增的P32基因長度為875個核苷酸,共編碼284個氨基酸。核苷酸序列與已發(fā)表的牛的4種泰勒蟲的主要表面蛋白基因相比較,其與瑟氏泰勒蟲俄羅斯株、日本株、中國遼陽株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推導的氨基酸序列中有3個糖基化位點。

呂氏泰勒蟲;表面蛋白P32基因;克隆;序列分析

綿羊和山羊泰勒蟲病(Ovine and caprine theileriosis)是媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內(nèi)所引起的疾病的總稱[1]。在我國,羊泰勒蟲病主要由青海血蜱與長角血蜱傳播,且該病分布與傳播媒介蜱的分布息息相關(guān)。羊泰勒蟲主要分布于我國的四川、青海、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、河北和寧夏等地。該病可引起羔羊與外地引進羊大量死亡,使慢性發(fā)病的山羊和綿羊發(fā)育遲緩,產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降,從而給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[2]。

泰勒蟲主要表面蛋白P32基因是紅細胞感染階段的一種蟲體表面蛋白[3],具有較好的免疫原性與反應(yīng)原性[4],是診斷和預(yù)防泰勒蟲病理想的抗原。近年國內(nèi)外尚未見該基因在羊泰勒蟲方面的報道。本試驗采用RT-PCR方法,克隆呂氏泰勒蟲主要表面蛋白P32基因,并與GenBank中登錄的牛的4種泰勒蟲主要表面蛋白基因進行相似性分析,為我國羊泰勒蟲病的免疫診斷和防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體 呂氏泰勒蟲寧縣株是采自甘肅省寧縣疫區(qū)感染羊的血液,從試驗接種切除脾臟的羊分離獲得。

1.1.2 動物 6月齡～12月齡的羔羊購自無泰勒蟲病和媒介蜱分布的地區(qū)。在試驗開始前30 d,所有用于蟲體繁殖的羊均被切除脾臟,并進行病原學檢查,只有血涂片檢查無任何血液原蟲感染的動物才能用于本試驗。

1.1.3 主要生化試劑 RNA抽提試劑Trizol L S Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA片段純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,TaqDNA 聚合酶、dNTP、EcoR Ⅰ、X-gal、DNA Marker、JM109感受態(tài)細胞均購自寶生物工程(大連)有限公司;pGEM-T Easy載體購自Promega公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體分離與純化 用液氮中保存的含蟲血液分別接種動物,當染蟲率達到15%以上,靜脈采血,采用低滲崩解、差速離心等方法分離純化羊泰勒蟲裂殖子。

1.2.2 蟲體RNA的提取 按Trizol RNA抽提試劑盒說明書進行,所用器皿和試劑經(jīng)DEPC水處理。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛瑟泰勒蟲主要表面蛋白P32基因序列,在基因開放閱讀框兩側(cè)合成了一對引物,預(yù)擴增長度為875 bp。該引物由寶生物工程(大連)有限公司合成 。 引 物 1:5′-CACGCTATGT TGTCCAAGAG-3′,引物 2:5′-TGTGACACTCAATGCGCCTA-3′。

1.2.4 目的基因的RT-PCR擴增 PCR擴增在50 μ L反應(yīng)體系中進行,該系統(tǒng)中含 10×PCR緩沖液 5 μ L,dNTP 混合 物 4 μ L,上 下 游 引 物 1 μ L 20 pmol/μ L,DNA 模板 1.25 μ L,滅菌去離子水37.75 μ L,TaqDNA 聚合酶 0.25 μ L,反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃1 min,30個循環(huán);72℃再延伸5 min。

1.2.5 PCR擴增片段的純化與回收 按寶生物工程(大連)有限公司DNA膠回收試劑盒使用說明書,純化并回收擴增的目的基因片段。

1.2.6 目的基因的克隆 將回收的PCR產(chǎn)物按試劑盒說明書連接到pGEM-T Easy載體上,總體積為10 μ L,混勻后于4℃過夜,然后導入JM109感受態(tài)細胞,輕輕地振蕩混勻,冰浴30 min,42℃熱激90 s,立即冰浴 3 min。然后加入 800 μ L 預(yù)熱至37℃的 LB培養(yǎng)基,37℃以150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,室溫800 r/min離心 5 min,棄上清液?；旌鲜Ｓ嗟呐囵B(yǎng)液和細胞沉淀,在無菌條件下涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/mL)、X-gal 16 μ L 、IPTG 4 μ L 的LB瓊脂平板上,于37℃培養(yǎng)12 h～16 h后轉(zhuǎn)移至4℃,使藍斑充分顯現(xiàn),挑取白色菌落,用質(zhì)粒提取試劑盒純化質(zhì)粒,然后用EcoRⅠ酶切鑒定并進一步作PCR鑒定。

1.2.7 目的基因的核苷酸序列測定 將酶切和PCR擴增鑒定均為陽性的克隆過夜培養(yǎng),取1 mL菌液送寶生物工程(大連)有限公司,用雙脫氧鏈終止法進行測序。DNA Star 6.0軟件分析其推導的氨基酸序列,并與已發(fā)表的牛的泰勒蟲同基因推導的基因氨基酸序列進行相似性比較。

1.2.8 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析 登錄http://www.expasy.org網(wǎng)站進行信號肽和跨膜區(qū)分析,并檢索蛋白質(zhì)的功能位點。

2 結(jié)果

2.1 主要表面蛋白P32基因的RT-PCR擴增

對呂氏泰勒蟲寧縣株的主要表面蛋白P32基因進行了RT-PCR擴增,產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行了檢測。結(jié)果在875 bp處有1條較亮的特異性擴增帶(圖1),與預(yù)期的擴增片段相符,且特異性和重復性好。初步表明用RT-PCR方法獲得的擴增片段為主要表面蛋白P32基因片段。

圖1 目的基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The RT-PCR products of P32 gene

2.2 目的基因的核苷酸序列測定

將擴增得到的P32基因cDNA片段克隆進pGEM-T Easy載體中,篩選出含有P32基因的陽性克隆,測定其核苷酸序列,獲得呂氏泰勒蟲寧縣株主要表面蛋白P32基因的核苷酸序列,并據(jù)此推導出其相應(yīng)的氨基酸序列(圖 2)。下劃線部分為信號肽;陰影部分為糖基化位點。

結(jié)果表明,插入片段的長度為875 bp,含有一個完整的開放閱讀框,編碼284個氨基酸,氨基酸的分子質(zhì)量約為32 ku。其中N端23個氨基酸為信號肽。本研究克隆測序得到的P32基因序列已提交GenBank,登錄號為GQ281044。

圖2 呂氏泰勒蟲主要表面蛋白P32基因推導的氨基酸序列Fig.2 The deduced amino acid sequence from P32 gene of Theileria luwenshuni

2.3 主要表面蛋白P32基因序列分析

將所測定的P32基因序列通過NCBI BLAST程序與GenBank中注冊的牛的泰勒蟲主要表面蛋白基因的核苷酸序列進行分析比較,其核苷酸序列同源性見表1。核苷酸同源性分析表明,分離的呂氏泰勒蟲寧縣株主要表面蛋白P32基因核苷酸序列與牛瑟氏泰勒蟲日本株(AB016280)、俄羅斯株(AB016279)、我國遼陽株(FJ515688)的同源性分別為99.6%、99.8%、99.7%;而與水牛泰勒蟲、中華泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、小泰勒蟲的同源性較低,分別是85.3%、73.5%、52.3%、49.0%。通過所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖3),呂氏泰勒蟲寧縣株與3株牛的瑟氏泰勒蟲位于同一小分支,而與水牛泰勒蟲、中華泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、小泰勒蟲明顯位于不同的進化支。

表1 呂氏泰勒蟲主要表面蛋白P32基因與已發(fā)表的主要表面蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性比較Table 1 Comparison of MPSP P32 of Theileria luwenshuni nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences of 8 published MPSP genes

圖3 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phy logenetic tree

2.4 蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)分析

應(yīng)用位于Expasy站點上的各種分析軟件對蛋白質(zhì)序列進行了分析。信號肽分析表明,1位～23位氨基酸殘基為信號肽序列(圖2),推斷該蛋白為融合性蛋白。蛋白跨膜區(qū)分析表明,在2位～21位、266位～282位之間存在兩個跨膜區(qū)。

2.5 功能位點分析

經(jīng)采用 http://www.expasy.org/prosite的PROSIT E數(shù)據(jù)庫檢索,該蛋白序列包含3個糖基化位點、4個絲氨酸磷酸化位點、4個蘇氨酸磷酸化位點和3個酪氨酸磷酸化位點。

3 討論

羊泰勒蟲病是嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)的蜱傳性血液原蟲病,是我國北方農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)及半林半牧區(qū)綿羊、山羊的常發(fā)病之一。目前國內(nèi)外報道的羊泰勒蟲至少有6個種,即萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、分離泰勒蟲(T.separata)、隱藏泰勒蟲 (T.recondita)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)和尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)。其中綿羊泰勒蟲、分離泰勒蟲和隱藏泰勒蟲屬于溫和型泰勒蟲;萊氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲屬于惡性泰勒[5-7]。然而,呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲屬于我國的2個新種,它們分別由長角血蜱與青海血蜱傳播[8-9]。根據(jù)羊泰勒蟲病傳播與發(fā)展的三個環(huán)節(jié),即泰勒蟲、媒介蜱和宿主(綿羊和山羊)之間的復雜關(guān)系以及泰勒蟲主要表面蛋白是紅細胞感染階段的一種蟲體表面蛋白,具有較好的免疫原性,是診斷和預(yù)防泰勒蟲病的理想抗原。筆者從血液中分離純化出呂氏泰勒蟲裂殖子,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,經(jīng)RT-PCR擴增出875 bp的基因片段,將該基因片段克隆到pGEM-T Easy載體,測得呂氏泰勒蟲寧縣分離株P(guān)32基因的核苷酸序列。經(jīng)分析表明,該株呂氏泰勒蟲的核苷酸與對應(yīng)的氨基酸與牛的瑟氏泰勒蟲的同源性較高,其中與瑟氏泰勒蟲日本株(AB016280)、俄羅斯株(AB016279)、我國遼陽株(FJ515688)的核苷酸同源性分別為99.6%、99.6%和99.7%;氨基酸同源性分別為98.9%、99.3%和98.9%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,呂氏泰勒蟲寧縣株與日本株、俄羅斯株和遼陽株進化途徑一致,位于同一小分支。而與水牛泰勒蟲、中華泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲和小泰勒蟲明顯處于不同的進化分支上。本試驗中主要表面蛋白P32基因序列在泰勒蟲當中的保守性高,對抗原性影響較小。本研究數(shù)據(jù)已提交至GenBank,登錄號GQ281044,為我國羊泰勒蟲病的監(jiān)測與防控提供了理論依據(jù)和技術(shù)資料儲備。同時用生物學軟件分析發(fā)現(xiàn),主要表面蛋白序列含有3個糖基化位點,11個磷酸化位點及2個跨膜區(qū)。

隨著我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展與傳播媒介長角血蜱與青海血蜱的分布范圍的擴大,羊泰勒蟲病的危害越來越嚴重,能有效、快速預(yù)防和檢測羊泰勒蟲病成為當務(wù)之急。國內(nèi)對羊泰勒蟲病的檢測主要依據(jù)血涂片染色鏡檢和血清學方法,而這兩種方法存在誤差大、抗原來源不足等缺點。由于裂殖子是泰勒蟲的主要致病階段,因此,裂殖子表面抗原的研究始終是一個熱點。研究最多的是泰勒蟲蟲體表面抗原(裂殖子表膜蛋白,又稱p32),該抗原是被宿主免疫系統(tǒng)識別的一種主要靶抗原,具有很強的免疫原性[14],通過免疫電鏡發(fā)現(xiàn)其在裂殖子表面大量表達。筆者將進一步把首次從國內(nèi)分離的這株呂氏泰勒蟲表面蛋白P32基因分析其抗原性,為今后羊泰勒蟲病的診斷和控制奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequencing Analysis of the Major Surface Protein P32 Gene ofTheileria luwenshuni

LIU Ai-hong,GUAN Gui-quan,LIU Jun-long,LI You-quan,MA Mi-ling,NIU Qing-li,REN Qiao-yun,YIN Hong,LUO Jian-xun

(Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province,State Key Laboratory on Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu,730046,China)

The major surface protein P32 gene ofTheileria luwenshuniisolated from Ningxian county in Gansu province was successfully amplified by RT-PCR.The amplicon was 875bp in length,coding for 284 amino acid residues,and had above 98.9%of identity with three strainsT.sergentifrom Jap/Rus/China.The deduced peptide of 284 amino acid residues contained 3 glycosylation sites.The research data were submitted to GenBank and gained a new accession No.GQ281044.The result provided the foundation of the immunological diagnosis and prevention for ovine theileriosis in our county.

Theileria luwenshuni;surface protein P32 gene;clone;sequence analysis

S852.7

A

1007-5038(2010)02-0007-04

2009-08-27

國家自然科學基金項目(30571397);國家(863)項目(2006AA10A206);國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006AA10A207)

劉愛紅(1975-),女,甘肅隴西人,助理研究員,碩士,主要從事獸醫(yī)原蟲分子生物學研究。*通訊作者