賈懷杰,王曉霞,房永祥,陳國華,李玩生,竇永喜,李克斌,2,瞿惠玲,2,3,景志忠*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,甘肅蘭州 730046;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省獸醫(yī)局,甘肅蘭州 730030)

豬圓環(huán)病毒2型甘肅株全基因組克隆及序列分析*

賈懷杰1,王曉霞1,房永祥1,陳國華1,李玩生1,竇永喜1,李克斌1,2,瞿惠玲1,2,3,景志忠1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,甘肅蘭州 730046;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省獸醫(yī)局,甘肅蘭州 730030)

參照GenBank中登錄的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)全基因組序列,設(shè)計合成了兩對特異性引物,從甘肅白銀疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)病料中提取病毒DNA,分步擴(kuò)增全基因組?；厥誔CR產(chǎn)物,將其插入pGEM-T Easy載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-PCV-2,轉(zhuǎn)化后篩選、提取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。結(jié)果表明,克隆到的PCV-2全基因組長度為1 767 bp。應(yīng)用DNA Star序列分析軟件,對所測PCV-2序列與GenBank中登錄的包括甘肅在內(nèi)的國內(nèi)外PCV毒株進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示,克隆的PCV-2與英國株(UK-EU656143)遺傳關(guān)系最近,其核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列同源性高達(dá)96.2%和91.0%,與已報道的2株甘肅毒株(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482)遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),可能是流行于甘肅白銀的一個變異毒株(GSBY)。

豬圓環(huán)病毒2型;基因組;克隆;序列分析

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等的主要病原。自1991年P(guān)MWS在北美洲最先發(fā)現(xiàn)以來,已在世界范圍內(nèi)流行[1]。郎洪武等[2]首次報道中國豬群存在PCV-2感染,感染率為42.9%。周緒斌等[3]報道,我國在2000年-2005年期間20多個省市PCV-2感染平均陽性率達(dá)55.0%。由于PCV-2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致感染豬免疫抑制,易繼發(fā)感染其他病毒和細(xì)菌[4-6],能引起多種疾病,防控難度加大。PMWS既可水平傳播,導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡,亦可垂直傳播,引起繁殖障礙[5],仔豬死亡率明顯升高,對中國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,成為目前中國養(yǎng)豬業(yè)重要傳染病之一。

在我國養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中,PCV-2的混合感染和持續(xù)性感染非常普遍,僅僅依賴單一疫苗防控顯然是不夠的,因此,需對該病進(jìn)行系統(tǒng)研究和重新認(rèn)識。本試驗采用PCR分步擴(kuò)增技術(shù),從疑似 PMWS病料中克隆PCV-2的全基因組,分析地方毒株間的差異,探討PCV-2毒株間的基因組序列的變異規(guī)律,從而為研究其生物學(xué)特性、流行病學(xué)、致病機(jī)理等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來自甘肅白銀某豬場疑似PMWS病死豬的組織(包括肺、淋巴結(jié)、肝和腎)。pGEM-T Easy Vector購自Promega公司,病毒DNA/RNA提取試劑盒、PCR試劑盒(包括TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer)、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、DNA Marker DL 2 000均購自寶生物工程(大連)有限公司;氨芐青霉素(Amp)購自Amresco公司。宿主菌大腸埃希菌DH5α由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存。DNA膠回收試劑盒購自博大泰恒公司。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank發(fā)表的PCV-2全基因序列,利用Oligo6.0生物軟件設(shè)計2對引物分A、B兩段進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增大小分別為1 141 bp和1 169 bp的A、B片段。其序列如下:

以上引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并經(jīng)PAGE電泳純化,使用前用滅菌三蒸水溶解 ,濃度為 25 μ mol/L,置-20 ℃保存。

1.2.2 模板的制備 將所采病料加入石英砂充分研磨,反復(fù)凍融3次,5 000 r/min離心5 min,取0.25 mL上清,按照寶生物工程(大連)有限公司病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA。取適量用作PCR模板。

1.2.3 PCV-2全基因片段的PCR擴(kuò)增

1.2.3.1 A、B片段的PCR擴(kuò)增 建立50 μ L PCR反應(yīng)體系 ,DNA 模板 3 μ L,10 ×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 4 μ L,25 μ mol/L上下游引物各1 μ L,TaqDNA 聚合酶0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L 。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min;94℃1 min,58℃1 min,72℃1.5 min,共 35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。B片段PCR擴(kuò)增:建立50 μ L PCR反應(yīng)體系,DNA 模 板 3 μ L,10 ×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNT Ps 4 μ L,25 μ mol/L 上 下游引物各 1 μ L,TaqDNA 聚 合 酶 0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃1 min,55℃1 min,72℃1.5 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,各取5 μ L PCR產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。建立50 μ L PCR 反應(yīng)體系,分別擴(kuò)增 A、B 片段:DNA 模 板 3 μ L,10 × PCR buffer5 μ L,2.5 mmol/L dNT Ps 4 μ L,25 μ mol/L 上 下游引物各 1 μ L,TaqDNA 聚 合 酶 0.5 μ L,加 H2O 至50.0 μ L。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性 5 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃1.5 min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.2.3.2 A、B片段PCR產(chǎn)物的回收 PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,以DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,按說明書操作,電泳鑒定回收的PCR產(chǎn)物。

1.2.3.3 全基因組片段的PCR擴(kuò)增 以回收的A、B片段PCR產(chǎn)物為模板、A1和 B2為上、下游引物擴(kuò)增PCV-2全基因組。建立50 μ L PCR反應(yīng)體系,A、B片段 PCR 產(chǎn)物各 1 μ L,10×PCR buffer 5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 4 μ L,TaqDNA 聚合酶0.5 μ L,最后加水至49 μ L。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃1 min,56.7℃1 min,72℃2 min,1個循環(huán),停止 PCR儀運行,補加 A1和 B2各0.5 μ L,94 ℃1 min,56.7 ℃1 min,72 ℃2 min,再運行34個循環(huán);最后72℃后延伸30 min。反應(yīng)結(jié)束后,各取5 μ L PCR產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化 按分子克隆操作把回收的目的基因片段和pGEM-T Easy載體連接。連接體系 :2×Rapid Ligation buffer 5.0 μ L,目的片 段 2 μ L,pGEM-T Vector 1.0 μ L,T4 DNA Ligase 1.0 μ L,補加去離子水至終體積 10 μ L 。連接產(chǎn)物于 4℃連接過夜、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α,并涂布于含氨芐(50 mg/L)的瓊脂LB平板上,37℃恒溫培養(yǎng)12 h～16 h。菌落經(jīng)PCR鑒定后,挑取單個陽性菌落接種于含氨芐(50 mg/L)的液體LB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng),按照博大泰恒公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,PCR和EcoRⅠ酶切鑒定。

1.2.5 陽性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 隨機(jī)挑取上述轉(zhuǎn)化平皿中的白色單菌落,接種到含氨芐的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜培養(yǎng),至培養(yǎng)液呈云霧狀,對菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定,篩選陽性克隆。

1.2.6 序列分析 將陽性重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,并與GenBank中登錄的國內(nèi)外毒株進(jìn)行序列的同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 PCV-2全基因片段的PCR擴(kuò)增

2.1.1 PCV-2 A、B片段的 PCR擴(kuò)增 以疑似PMWS病死豬的組織提取病毒的DNA,以此DNA為膜板,以A1和A2,B1和B2為引物分別進(jìn)行A和B片段的 PCR擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增出了大小約1 100 bp的兩個片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.1.2 PCV-2全基因片段的PCR擴(kuò)增 以回收的A、B片段PCR產(chǎn)物為模板,A1、B2為上、下游引物擴(kuò)增PCV-2全基因組,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果擴(kuò)增出了1 800 bp左右的特異性片段,暫定為PCV-2甘肅白銀株(PCV-2-GSBY)基因組序列,與預(yù)期片段大小相符(圖2)。

2.2 全基因組的克隆與鑒定

將擴(kuò)增純化產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接后,轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α,經(jīng)過PCR、酶切快速鑒定和測序結(jié)果表明,克隆的陽性重組質(zhì)粒均帶有相應(yīng)的目的片段(圖3和圖4)。

圖1 PCV-2 A、B片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of A and B fragments of PCV-2 by PCR

圖2 PCV-2全基因組的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of PCV-2 genome by PCR

圖3 重組質(zhì)粒pGEM-PCV-2 PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pGEM-PCV-2 by PCR

圖4 重組質(zhì)粒pGEM-PCV-2的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pGEM-PCV-2 by digestion

2.3 測序和序列比較

將經(jīng)PCR和酶切鑒定陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。所得病毒基因組序列長度為1 767 bp,與預(yù)期結(jié)果相符。用DNA Star軟件將所克隆的PCV-2 GSBY的全基因組核苷酸序列、ORF1的氨基酸和ORF2的氨基酸與GenBank的代表毒株核苷酸及氨基酸進(jìn)行比對,并繪制其進(jìn)化樹。PCV-2毒株間的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較,結(jié)果顯示,所有 PCV-2毒株間同源性均很高,分別為95.3%～99.7%、62.4%～99.5%,本研究所克隆的PCV-2 GSBY毒株的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其他毒株的同源性在95.3%～96.2%、62.4%～91.0%之間。

將編碼PCV-2主要蛋白(Rep蛋白和Cap蛋白)的2個閱讀框(ORF1與ORF2)進(jìn)行了氨基酸序列的變異分析。結(jié)果顯示,ORF1編碼的Rep蛋白的氨基酸序列同源性為95.2%～100%;ORF2編碼Cap蛋白的氨基酸同源性為79.1%～100%,說明不同PCV-2毒株之間ORF1比較穩(wěn)定,ORF2相對差異較大。本研究分離克隆的PCV-2 GSBY的Rep、Cap蛋白與其他毒株的氨基酸序列比較,同源性分別為95.2%～96.2%和79.1%～88.0%(表1)。

表1 PCV-2毒株核苷酸、Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸同源性比較Table 1 Homological comparison of the nucleotide,Rep protein,Cap protein of PCV-2 strains

表1中對應(yīng)的GenBank登錄號如下:甘肅蘭州株(GSLZ-FJ447482),甘肅株(GS03-EU547458),臺灣株(Taiwan-AF166528),加拿大株(Canada-AF408635),美國株(USA-AJ223185),法國株(France-AY321987),英國株(UK-EU656143),山東株(Shandong-DQ346683),丹麥株(Denmark-EF565349),河南株(Zhoukou-EU656143)。

為了更好地了解PCV-2 GSBY毒株的分類地位及其遺傳演化關(guān)系,在分析PCV毒株同源性的基礎(chǔ)上與GenBank的16株P(guān)CV-2和2株P(guān)CV-1代表毒株核苷酸遺傳進(jìn)化分析,并繪制了其系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(圖6)。從圖中可以看出,PCV-1和PCV-2兩個基因型間差異較大,明顯分為兩支。PCV-2各個分離毒株間在進(jìn)化上存在著某些地理位置上的相關(guān)性,分為兩大主群。一群以北美洲地區(qū)分離毒株為主,主要有加拿大株和美國株。另一群以歐洲地區(qū)分離毒株為主,主要有英國株、法國株和丹麥株等,還有部分中國分離毒株。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株與英國株同源性較高,被分在同一主支上,在此主支中又由兩個分支組成。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株與已報道的GS03(EU547458)、GSLZ(FJ447482)和山東(DQ346683)等其他國內(nèi)分離(流行)毒株關(guān)系較遠(yuǎn),被分在兩個不同的小分支上,而后處于一個小的分支。

圖5 PCV進(jìn)化樹分析圖Fig.5 Phylogenetic tree of PCV

2.4 PCV-2 GSBY株ORF2基因編碼的氨基酸抗原性和親水性分析

測序結(jié)果表明PCV-2 GSBY株ORF2基因長702 bp,編碼230個氨基酸,其推導(dǎo)的氨基酸序列如下所示:LRVKWGVFKIKFSELYIHGYTDIVVLVVYTVFERSAEAYMVYISSSLSQPELISFVIGLEVIDCPIKDRFGGEIAGVVGEGLGYGMAGGVVYIGVIG.GISLCYKVIINNSSGAHSPVT LGDWGAGPESNLNLPYSVVFKGHSEGVAPSWGKKIINIKSHHVHIPGGRSYCGSFDSITDGAGEAGVEDAIFPSPAVTVAGVDEPGAAAEDLAKMAAGAVSSSSVTPPWIRH。分子質(zhì)量大約為 24 ku。該蛋白含有15個堿性氨基酸(K,R),且有多處串聯(lián)的堿性氨基酸(R);22個酸性氨基酸(D,E);91個親水性氨基酸(A,I,L,F,W,V);45個極性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。

利用DNA Star軟件對Cap蛋白的抗原表位預(yù)測,ORF2編碼的氨基酸在第68位～73位、113位～116位 、129位 ～133位、143 位～148位、169位～174位、181位～184位和205位～209位可能存在抗原表位(圖6)。對ORF2編碼蛋白的親水性分析表明,該蛋白具有較強的親水性(圖7)。

圖6 GSBY株ORF2多肽抗原表位分析Fig.6 Antigenicity of ORF2 protein of GSBY

圖7 GSBY株ORF2多肽親水性分析Fig.7 Hydrophilicity of ORF2 protein of GSBY

3 討論

PCV-2被認(rèn)為是PMWS、豬皮炎-腎炎綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、先天性震顫(CT)等疾病的主要病原。該病毒引起的疾病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了的巨大經(jīng)濟(jì)損失,己引起各國高度重視。

豬圓環(huán)病毒(PCV)有2種基因型,即PCV-1和PCV-2,其中 PCV-1全基因組大小為 1 759 bp,PCV-2全基因組大小有1 767 bp或1 768 bp 2種。PCV-2有11個開放閱讀框(ORFs),研究較多的是ORF1和ORF2,其中對ORF2的研究已成為熱點。PCV-2的ORF編碼Rep蛋白的有945個堿基,編碼314個氨基酸,有3個糖基化位點,其編碼蛋白與PCV的復(fù)制相關(guān),與PCV-1的ORF1編碼蛋白有相同的抗原性。ORF2編碼的Cap蛋白是PCV-2的核衣殼蛋白,具有很好的免疫原性,是構(gòu)建重組疫苗和檢測病原的首選基因[7-8]。Mahe等用桿狀病毒和質(zhì)粒載體表達(dá)了ORF1和ORF2,發(fā)現(xiàn)PCV-1 ORF2雖與PCV-2 ORF2的抗原性相關(guān),但只有ORF2蛋白可以被PCV-2多抗識別。Liu Q等[8]將ORF2基因連接到MBP-His(8)-tag基因3′端,在細(xì)菌中表達(dá)了ORF2融合蛋白,該融合蛋白可以與PCV-2的多抗反應(yīng)。這一結(jié)果表明,可以用ORF2來區(qū)分PCV-1和PCV-2。

雖然PCV在進(jìn)化上比較保守,但是引起的臨床疾病卻廣泛多樣,而且病毒基因會隨著時間的推移逐漸發(fā)生變異。據(jù)報道,病毒在連傳120代的過程中發(fā)生了堿基突變,使得病毒的復(fù)制能力提高[9-10]。而且,病毒隨著時間的流逝也逐漸發(fā)生了變異,這些變異是否導(dǎo)致毒力發(fā)生變化,至今為止,還未能證明當(dāng)前不同國家和不同臨床病癥下分離到的PCV-2毒株間的致病性有何差異。目前,雖然PCV的研究己取得了很大的進(jìn)展,但病毒是從何而來的,是如何傳入家豬群的,又是如何演變的,尚不十分明了。因此,對PCV-2毒株基因組序列差異的研究,有助于闡明疫病暴發(fā)的真正原因。

本研究克隆的甘肅白銀流行毒株(PCV-2 GSBY)基因組大小為1 767 bp,與其他PCV-2毒株全基因組核苷酸序列同源性在95.7%～96.2%之間,而與PCV-1核苷酸同源性僅為77.4%～83.6%,說明PCV-2 GSBY與所有PCV-2毒株間有較近的遺傳演化關(guān)系,與PCV-1間關(guān)系較遠(yuǎn)。已有研究證實,盡管PCV-2基因組比較保守,但也存在著變異,變異的發(fā)生與地理分布有某種程度上的相關(guān)性。從遺傳進(jìn)化樹上可以看出,目前全球圓環(huán)病毒2型主要有兩大群,即以英國毒株為主的歐洲群和以美國和加拿大毒株為主的美洲群,而這兩大洲是發(fā)生豬圓環(huán)病毒病較早的地區(qū)。另外,還可看出國內(nèi)毒株與歐洲株遺傳關(guān)系較近。根據(jù)流行病學(xué)的情況,該病在亞洲地區(qū)是近些年發(fā)生的,這提示我們,我國豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生可能與在不同地區(qū)、不同時間引種有關(guān)。本研究克隆的PCV-2 GSBY毒株與英國株(UK-EU656143)關(guān)系最為密切,而與已報道的兩株甘肅毒株(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482)關(guān)系較遠(yuǎn),說明該毒株可能是流行于甘肅的一個變異毒株,這些研究結(jié)果將為甘肅PCV的流行病學(xué)和疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

本研究從甘肅省白銀市某豬場采集疑似PMWS癥狀的病料,采用PCR檢測方法對 PCV-2進(jìn)行DNA病原檢測,對其陽性病料的PCV-2進(jìn)行全基因組擴(kuò)增、克隆和測序,分析甘肅白銀流行株基因組、ORF2編碼Cap蛋白與國內(nèi)外分離株間的遺傳演化關(guān)系以及抗原性,補充了 PCV-2流行病學(xué)資料,為我國深入研究和防控該病奠定了基礎(chǔ)。

[1]Segale S J,Domingo M.Postweaning multisystemic wasting syndrome(PM WS)in pigs:a review[J].Vet Q,2002,24(3):109-124.

[2]朗洪武,張廣川,吳發(fā)權(quán),等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(3):3-5.

[3]周緒斌,張馨玉,許秀梅.我國豬圓環(huán)病毒2型的流行情況和分析[J].中國豬業(yè),2007(5):37-41.

[4]Kim J,Chung H K,Chae C.Association of porcine circo-virus 2 with porcine respiratory disease complex[J].Vet J,2003,166(3):251-256.

[5]Ellis J,Clark E,Haines D,et al.Porcine circovirus2 and concurrent infections in the field[J].Vet Microbiol,2004,98(2):159-163.

[6]Sarli G,Mandrioli L,Laurenti M,et al.Immunohistochemical characterization of the lymph node reaction in pig post-weaning multisy stemic wasting syndrome(PM WS)[J].Vet Immunol Immunopathol,2001,83(12):53-67.

[7]Blanchard P,M ah D,Cariolet R,et al.Protection of swine against-postweaning multisystemic wasting syndrome(PM WS)by porcine circovirus type2(PCV2)proteins[J].Vaccine,2003,(21):4 565-4 575.

[8]Liu Q,Willson P,Attoh-poku S,et al.Bacterial expression of an immunologically reactive PCV2 fusion protein[J].Protein Expr Purif,2001,21(1):115-120.

[9]Ellis J,Krakiwka S,Lairmore M,et al.Reproduction of lesions of post-weaning multisy stemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets[J].J Vet Diagn Invest,1999,11:3-14.

[10]溫永俊,吳國軍,蔡雪輝,等.豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染對仔豬致病性的評估[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2007,29(5):336-340.

Cloning and Sequence Analysis of the Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 Gansu Isolate

JIA Huai-jie1,WANG Xiao-xia1,FANG Yong-xiang1,CHEN Guo-hua1,LI Wan-sheng1,DOU Yong-xi1,LI Ke-bin1,2,QU Hui-ling1,2,3,JING Zhi-zhong1

(1.State K ey Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture,Lanzhou Veterinary Research Institute,CAAS,Lanzhou,Gansu,730046,China;2.Veterinary College of Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu,730070,China;3.Veterinary Bureau of Gansu Province,Lanzhou,Gansu,730030,China)

Two pairs of primers were designied and synthesized according to the full length genome of PCV-2 in GenBank.Virus DNA was extracted from samples of suspected postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)pig in Baiyin,Gansu province,and the full length genome of PCV-2 was cloned into pGEM-T easy vector,recombinant vector pGEM PCV-2 was constructed and then sequenced.Sequence analysis with DNA Star software showed that the genome of PCV-2 Gansu Baiyin isolate(GSBY)is 1 767 bp,the results of homology comparison of the full length genome among isolates published in GenBank indicated that GSBY isolate displayed high nucleotide and amino acid identities with England(UKEU656143)isolate(96.2%nucleotide identity and 91.0%amino acid identity),but was different from other two Gansu epidemic isolates(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482).So GSBY isolate in this test may be a variant isolate prevalent in Baiyin,Gansu.

Porcine circovirus type 2;genome;cloning;sequence analysis

Q78;S852.659.2

A

1007-5038(2010)02-0001-06

2009-05-26

國家自然基金項目(30871884);國家支撐計劃(2006BAD31B03)和甘肅省支撐計劃項目(0804NKCA076)

賈懷杰(1980-),男,甘肅臨夏人,研究實習(xí)員,碩士,主要從事人獸共患病及病原與宿主分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者