付笑飛 趙 松 劉東雷 王建軍 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院,湖北 武漢 430022)

在肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)的過程中細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺組織損傷的重要原因之一〔1〕。丙泊酚(propofol)是臨床常用的靜脈麻醉藥,已有研究表明其對 LIRI有一定的保護(hù)作用〔2〕,但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過建立大鼠在體 LIRI模型,觀察丙泊酚對 LIRI肺細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響,并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康雄性SD大鼠 42只,體重250～300 g(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供)。主要試劑:鼠抗Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz公司,美國)、原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑(Roche公司,德國)、二步法免疫組化檢測試劑(PV-6001)(北京中杉金橋生物科技有限公司)。主要藥物:丙泊酚注射液(Astra Zeneca公司,意大利)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為 3組,每組14只,分別為:假手術(shù)組(S組),除不作缺血處理外,余同其他組;肺缺血再灌注組(IR組),缺血 1 h,再灌 3 h;丙泊酚組(P組),缺血前 30 min靜脈輸注丙泊酚 5 mg/kg?h-1,缺血 1 h,再灌 3 h。IR組和P組每組又分為兩個(gè)亞組,再灌時(shí)間分別為1、3 h,每個(gè)亞組 7只大鼠。

實(shí)驗(yàn)前 4h禁食,腹腔注射4%戊巴比妥 50mg/kg麻醉后,仰臥位固定。行頸部氣管切開、插管,并游離右側(cè)頸靜脈和頸動脈。接動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣維持呼吸,右側(cè)經(jīng)靜脈插管、固定,接微量注射泵;然后左側(cè)第 5肋間開胸,鈍、銳性結(jié)合游離左肺門。靜息 5 min后,于呼氣末用無創(chuàng)血管夾阻斷左左主支氣管、左肺動脈和左肺靜脈。阻斷 1 h后開放,進(jìn)行再灌注1、3 h。于 1、3h實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)扎肺門取出左肺待用。

1.2.2 肺組織Bcl-2、Bax蛋白檢測 采用二步免疫組織化學(xué)法(PV)法檢測 Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況。各組標(biāo)本用 10%甲醛固定,石蠟包埋切片,嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行操作,陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色,陰性對照組用 PBS代替一抗。在顯微鏡下觀察,每張切片隨機(jī)選取 5個(gè)視野,使用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域平均光密度值(OD),以O(shè)D值大小代表陽性產(chǎn)物表達(dá)的多少。

1.2.3 原位細(xì)胞凋亡檢測 用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。光鏡下觀察細(xì)胞核染為棕黃色為凋亡細(xì)胞。每例標(biāo)本的切片隨機(jī)選取 5個(gè)高倍鏡視野(40×10),按凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%計(jì)算。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢測 4%多聚甲醛固定 24h,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下(×200)進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用 SPSS13.0軟件分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較采用 t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及 Bcl-2/Bax比值變化 與 S組相比,IR組、P組肺組織 Bcl-2、Bax蛋白含量均明顯增加(P＜0.05);與 IR組相比,P組 Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加,Bax表達(dá)減少(P＜0.05),見表 1。

表1 再灌注后不同時(shí)相Bcl-2、Bax蛋白(OD值)及 Bcl-2/Bax比值變化(x±s)

2.2 肺細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)變化 與 S組相比,IR組、P組肺AI值均明顯增加(P＜0.05);與IR組相比,P組各時(shí)相 AI值減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IR組、P組各組內(nèi)各時(shí)相均以再灌注 3h時(shí) AI值最高,見表 2。

表2 再灌注后不同時(shí)相肺細(xì)胞AI值變化(x±s)

2.3 肺組織病理學(xué)檢查 光鏡下觀察 HE染色病理切片,S組肺組織結(jié)構(gòu)完好,肺泡腔完整,無明顯滲出。水腫及炎性細(xì)胞浸潤;IR組肺泡壁明顯增厚,肺泡腔縮窄,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤;P組肺組織病理改變較IR組輕,表現(xiàn)為肺泡壁輕度水腫及增厚,肺泡內(nèi)可見中性粒細(xì)胞浸潤。

3 討 論

LIRI可發(fā)生于多種臨床情況,是肺移植早期和心肺轉(zhuǎn)流術(shù)后肺功能障礙的重要原因之一,而在LIRI發(fā)生過程中,由于細(xì)胞內(nèi)活性氧增加、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)及持續(xù)的低 pH等多種誘因,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡從而使肺功能受損。研究表明,Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中的重要成員,Bcl-2是主要的抑凋亡基因,它主要通過阻止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素 C的釋放、抑制 caspase-3激活來阻止細(xì)胞凋亡〔3〕;Bax是 Bcl-2的同源體,其作用是通過抑制 Bcl-2來促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕,Bcl-2/Bax的比例關(guān)系與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)〔5〕。本研究中觀察到 IR組、P組肺細(xì)胞AI值與 S組相比明顯增加(P＜0.05),證實(shí)了細(xì)胞凋亡在LIRI中起到重要作用。與 IR組相比,P組可明顯增強(qiáng)肺組織 Bcl-2蛋白的表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá),使 Bcl-2/Bax比值增加而細(xì)胞凋亡指數(shù)降低,說明丙泊酚可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑來抑制 LIRI。

丙泊酚是一種新型的酚類靜脈麻醉藥,其化學(xué)成分為 2,6-二異丙基酚,大量研究顯示其對缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用,這種作用可能與其清除自由基的抗氧化作用有關(guān)〔6〕。本研究中病理切片觀察到給予丙泊酚后肺組織水腫及炎性滲出較IR組明顯減輕,說明丙泊酚可以通過減輕肺水腫起到對肺組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,這與徐詠梅等〔2〕的研究結(jié)論相一致。此外丙泊酚還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡起到抗凋亡的作用〔7〕。

1 Cobelens PM,Putte BP,Kavelaars A,et al.Inflammatory consequences of lung ischemia-reperfusion injury and low-pressure ventilation〔J〕.J Surg Res,2009;153(2):295-301.

2 徐詠梅,薄玉龍,呂湘琪,等 .丙泊酚對大鼠肺缺血-再灌注損傷的影響〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志,2007;23(9):756-8.

3 Park SE,Park C,Kim SH,et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells〔J〕.J Ethnopharmacol,2009;121(2):304-12.

4 Garcia EJ,Lawson D,Cotsonis G,et al.Hepatocellular carcinoma and markers of apoptosis(Bcl-2,Bax,Bcl-x):prognostic significance〔J〕.Applied Immunohistochem Mol Morphol,2002;10(3):210-7.

5 Huang YC,Chuang LY,Hung WC.Mechanisms underlying nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced p 27(Kip1)expression〔J〕.Mol Pharmacol,2002;62(6):1515-21.

6 Chen L,Gong Q,Xiao C.Effectsof propofol,midazolam and thiopental sodium on outcome and amino acids accumulation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats〔J〕.Chin Med J,2003;116(2):292-6.

7 曹江北,李云峰,米衛(wèi)東,等 .丙泊酚對細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)〔J〕.國外醫(yī)學(xué)?藥學(xué)分冊,2002;19(5):293-6.