丁成智 錢永躍 郭旭峰 徐中華 徐忠恒

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院胸心外科,江蘇 蘇州 215004)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌 80%,隨著對綜合治療和個體化治療的認識不斷加深和推廣,NSCLC的治療已經(jīng)有了很大提高,但目前 5年生存率仍低于 15%〔1〕。一般認為,腫瘤細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性是決定腫瘤類型和患者死亡的主要原因,因此明確腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞之間相互作用的分子機制對腫瘤的治療有重要意義。目前認為,抗腫瘤的血管生成和淋巴管生成是有效治療腫瘤的主要途徑之一〔2〕。我們前期研究結(jié)果已經(jīng)證實,肺癌細胞通過高表達血管內(nèi)皮生長因子 C(VEGF-C)與淋巴管內(nèi)皮細胞 VEGFR-3特異性結(jié)合刺激肺癌新生淋巴管生成〔3〕。本研究通過建立肺癌裸鼠皮下種植瘤模型,研究脂質(zhì)體介導的 VEGF-C反義寡核苷酸對肺癌細胞VEGF-C表達水平和種植瘤內(nèi)微淋巴管生成的影響,來尋找肺癌基因治療新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及動物 肺癌 A549細胞株由山東大學齊魯醫(yī)院胸外科胡國強教授惠贈,生長特性為貼壁生長,傳代培養(yǎng)。4～6周齡雌性 BALB/C系裸鼠 30只,購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自 GIBCO公司,胎牛血清系杭州四季青產(chǎn)品。全硫代磷酸化修飾的寡核苷酸均由上海生工公司合成,VEGF-C反義寡核苷酸序列為 5′-CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC-3′, 正 義 寡 核 苷 酸 序 列 為 5′-TACGTAGTATGGTGTACGATC-3′;RT-PCR試劑購自 Promega公司。 VEGF-C上游引物序列為 5′-CATGTACGAACCGCCAG-3′,下游引物序列為 5′-TTGGCTGTTTGGTCATTGGC-3′,擴增產(chǎn)物320 bp,β-actin上游引物序列為 5′-ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,下 游引物 序列為 5′-GGTACCACCATGTACCCAGG-3′,擴增產(chǎn)物 163 bp,由上海生工公司合成。兔抗人多克隆抗體VEGF-C、VEGFR-3及免疫組織化學試劑盒 PV-9000均購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人肺腺癌細胞株A 549裸鼠皮下種植瘤模型建立和分組 取對數(shù)生長期A 549細胞,經(jīng) 2.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA消化液消化后,PBS洗滌 2次,離心 5 min(1 500 r/min),棄上清,加生理鹽水制成單細胞懸液,細胞密度為 1×106個/ml,以0.2ml/只接種于 BALB/C小鼠右腋皮下。建模 1 w后,隨機分為磷酸鹽緩沖液對照組(PBS組)、正義和反義寡核苷酸對照組(SODN組和 AODN組),每組各 10只。

1.2.2 脂質(zhì)體(Lip)+ODN復合物的制備和作用 FuGENE 6 Lip由陽離子脂質(zhì) DOTMA和中性磷脂 DOPE按 1∶1(W/W)比例在膜過濾生理鹽水中合成,每毫升含 1 mg。按 1μg∶2μl的比例將AODN和SODN及脂質(zhì)體輕柔混勻,室溫下靜置30 min,制成 Lip+ODN復合物。

1.2.3 干預方法和動物取材 寡核苷酸用量為每次 10 mg/kg體重,隔日 1次,每周 3次,共 3 w,分別抽取 0.2 ml濃度為8 mg/μl的正義和反義 VEGF-C寡核苷酸 PBS溶液給 SODN和AODN組小鼠注射,PBS組僅注射 0.2 ml PBS。第 4周末時所有動物模型均存活,頸椎脫臼法處死裸鼠,立即剖出腫瘤,置入10%中性甲醛常規(guī)固定標本石蠟包埋,行HE染色。

1.2.4 種植瘤內(nèi) VEGF-C mRNA和蛋白表達量檢測 按照Trizol試劑盒說明提取種植瘤中總RNA,用引物 Oligo dT反轉(zhuǎn)錄 (RT)合成 cDNA鏈,RT反應產(chǎn)物用作PCR的模板DNA,使用特異性引物進行 PCR,β-actin作為內(nèi)參照。取 10μl PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂凝膠電泳,紫外燈下觀察電泳帶,應用Smart View凝膠成像分析系統(tǒng)及其分析軟件,以VEGF-C帶峰面積與內(nèi)參照β-actin帶峰面積的比值表示VEGF-C mRNA水平。Western印跡檢測 VEGF-C蛋白的表達。主要步驟包括:細胞總蛋白的提取,SDS-PAGE電泳,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印及抗體染色,Ecl試劑檢測、X-光電曝光及顯影。

1.2.5 免疫組織化學染色計數(shù)微淋巴管密度 采用免疫組化Wax Envision多聚復合物酶標法,具體步驟按照試劑盒說明書進行。陰性對照采用 0.01 mol/L PBS代替一抗。VEGFR-3蛋白陽性表達產(chǎn)物定位于微淋巴管內(nèi)皮細胞,呈棕紅色顆粒。腫瘤微脈管計數(shù)方法:判定標準為由內(nèi)皮細胞形成條狀、隙狀等孤立或簇狀結(jié)構(gòu)棕紅染色及有管腔者,先在低倍光鏡(×40)視野下尋找癌周組織微脈管最密集區(qū)即“熱點”(hot spot),然后在高倍鏡(×200)下觀察,以 4個高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示脈管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以 x±s表示,應用 SPSS l3.0軟件包單因素方差分析和 q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF-C反義寡核苷酸對種植瘤內(nèi) VEGF-C mRNA和蛋白表達的影響 PBS組、SODN組和 AODN組種植瘤 VEGF-C mRNA表達量分別為 24.13±3.34、20.74±3.59和 4.61±1.57。AODN組種植瘤 VEGF-CmRNA表達顯著減少,與對照組比較差異顯著 (P＜0.05),見圖 1。Western印跡檢測結(jié)果顯示 AODN組種植瘤 VEGF-C蛋白表達量亦明顯減少,見圖 2。

圖1 VEGF-C mRNA RT-PCR結(jié)果

圖2 各組瘤組織VEGF-C Western印跡檢測結(jié)果

2.2 VEGF-C反義寡核苷酸對種植瘤微淋巴管生成的影響PBS組、SODN組和 AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度分別為43.4±2.3、32.4±2.1和 3.2±1.7,AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度顯著減少,與對照組比較差異顯著 (P＜0.01),見圖 3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各瘤組織中微淋巴管免疫組化檢測結(jié)果(DAB,×400)

3 討 論

腫瘤細胞的血性和淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者生存的重要因素。而肺癌患者早期即可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移,這是長時間困擾臨床醫(yī)生的一個難題。有研究報道,肺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往預示著臨床結(jié)果的高危性〔3〕。因此,研究清除淋巴轉(zhuǎn)移的分子機制及有效抑制腫瘤細胞的淋巴轉(zhuǎn)移顯得十分必要。

腫瘤的淋巴管生成是指在腫瘤原位形成新的毛細淋巴管,它僅由單層淋巴內(nèi)皮細胞組成、基底膜不完整、管壁薄、流速緩慢、剪切力低且淋巴與組織間液的組成基本相同,因而有利于腫瘤細胞進入淋巴管道,進而形成淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移〔4～7〕。研究發(fā)現(xiàn) VEGF在腫瘤的生長和血管和淋巴管轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,特別是VEGF-C是作為特異性淋巴管內(nèi)皮細胞刺激因子,可通過誘導微淋巴管的生成使得腫瘤“淋巴管生成”失調(diào)控,并影響淋巴管內(nèi)皮的通透性,從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移〔5～7〕。Zip等〔8〕通過建立動物腫瘤轉(zhuǎn)移模型,研究 VEGF-C的促淋巴管生成機制,結(jié)果提示抑制 VEGF和 VEGFR的表達能顯著增加腫瘤對治療的敏感性。Miyata等〔9〕研究發(fā)現(xiàn) VEGF-C在腫瘤淋巴管生成中起決定作用。Maekawa等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在 T1肺腺癌中 VEGF-CmRNA和蛋白質(zhì)水平在 T1期肺腺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間無明顯差異,但 5年生存率優(yōu)于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的 T1期肺腺癌。因此,進一步探討肺癌中 VEGF-C介導的淋巴管生成機制及其干預措施對于尋找有效的肺癌抗淋巴管生成治療方法具有重要的實驗和臨床意義。

本研究通過建立肺癌裸鼠皮下種植瘤模型,應用反義核酸技術(shù),根據(jù)核酸堿基互補配對的規(guī)律設(shè)計出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的干擾 DNA,從而影響靶基因的表達。寡核苷酸干預后,RT-PCR和 Western印跡檢測結(jié)果顯示 AODN組種植瘤VEGF-C mRNA和蛋白表達量明顯為低,與 PBS和 SODN組比較差異顯著。分別從基因和蛋白質(zhì)水平上證實了 VEGF-C反義寡核苷酸可明顯抑制肺癌細胞 VEGF-C基因的表達,表明VEGF-C可能在促進肺癌淋巴管生成方面扮演著重要角色,同時也表明,VEGF-C反義寡核苷酸在抑制肺癌淋巴管生成中發(fā)揮了重要作用。

淋巴管密度是評價腫瘤淋巴管生成的重要指標。本研究中,AODN組種植瘤內(nèi)微淋巴管密度顯著低于兩對照組,提示VEGF-C反義寡核苷酸靶向抑制肺癌 A 549細胞 VEGF-C蛋白的表達,從而減少了VEGF-C與腫瘤淋巴管內(nèi)皮細胞上特異性受體 VEGFR-3的結(jié)合,進而降低肺癌淋巴管內(nèi)皮細胞有絲分裂和遷移游走的能力,抑制肺癌微淋巴管的生成。如此,將可能阻斷肺癌細胞通過新生淋巴管轉(zhuǎn)移至遠處淋巴結(jié)的通道,有效防止淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移。

綜上所述,我們認為VEGF-C反義寡核苷酸能有效抑制肺癌細胞 VEGF-C的微淋巴管基因表達,進而抑制肺癌細胞的增殖和淋巴轉(zhuǎn)移,可作為一種抗肺癌淋巴管生成治療方法。

1 Molina JR,Adjei AA,Jett JR.Advances in chemotherapy of non-small cell lung cancer〔J〕.Chest,2006;30(4):1211-9.

2 Hirakawa S,Brown LF,Kodama S,et al.VEGF-C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites〔J〕.Blood,2007;09(3):1010-7.

3 郭旭峰,胡國強,尹秋偉,等.PTTG、VEGF-C基因過表達與非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義〔J〕.山東大學學報(醫(yī)學版),2006;4(11):1175-9.

4 Zwaans BM,Bielenberg DR.Potential therapeutic strategies for lymphatic metastasis〔J〕.Microvascular Res,2007;74(2-3):145-58.

5 Karkkainen MJ,Haiko P,Sainio K,et al.Vascular endothelial growth factor Cis required for sproutingof the first lymphatic vessels from embryonic veins〔J〕.Nature Immunol,2004;5(1):74-80.

6 Rinderknecht M,Detmar M.Tumor lymphangiogenesis and melanomametastasis〔J〕.J Cell Physiol,2008;216(2):347-54.

7 Tobler NE,Detmar M.Tumor and lymph node lymphangiogenesis-impact on cancer metastasis〔J〕.J Leukoc Biol,2006;80(4):691-6.

8 Zips D,Krause M,Hessel F,et al.Experimental study on different combination schedulesof VEGFR inhibitor PTK 787/ZK222584 and fractionated irradiation〔J〕.Anticancer Res,2003;23(5):3869-76.

9 Miyata Y,Kanda S,Ohba K,et al.Lymphangiogenesis and angiogenesis in bladder cancer:prognostic implications and regulation by vascular endothelial growth factors-A,-C,and-D〔J〕.Clin Cancer Res,2006;12(3):800-6.

10 Maekawa S,Iwasaki A,Shirakusa T,et al.Correlation between lymph node metastasisand the expression of VEGF-C,VEGF-D and VEGFR-3 in T1 lung adenocarcinoma〔J〕.Anticancer Res,2007;27(6A):3735-41.