高 琳 楊遠航 徐萬海 林相國 李建章 楊德君 王曉民

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 哈爾濱 150001)

膜聯(lián)蛋白-1(Annexin-1)是上皮生長因子(EGFR)激酶的主要底酶,糖皮質(zhì)激素刺激其產(chǎn)生和活性。Annexin-1增強感染局部的凋亡表明它對腫瘤的診斷和治療有重要意義,因此提出該蛋白質(zhì)與腫瘤細胞的活性調(diào)節(jié)相關(guān)〔1,2〕。Annexin-1與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究針對 Annexin-1基因 mRNA序列設(shè)計合成與之互補的雙鏈小分子干擾 RNA(siRNA),在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細胞系,觀察對 Annexin-1基因 mRNA和蛋白表達及對順鉑敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 膀胱癌T24細胞株。

1.1.2 主要試劑 RNA干擾試劑盒(SilencerTMsiRNA Construction Kit)購自美國 Ambion公司。陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 LipofectamineTM2000、Trizol、M-MLV購自 Invitrogen生命技術(shù)公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自 Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計及合成 根據(jù)基因庫中 Annexin-1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和 siRNA設(shè)計原則,應(yīng)用 Ambion生物公司的設(shè)計軟件(siRNA Target Finder and Design Tools),自 Annexin-1 mRNA的起始密碼子開始,尋找“AA”二連序列,記下其 3′端的 19個堿基序列作為候選的 siRNA靶序列。將候選序列在基因庫中用 Blast軟件進行同源序列搜索,排除那些和其他基因編碼序列或基因表達序列標簽(EST)同源的候選序列。最終選擇了 3段 21個堿基的siRNA序列(TⅠ 、TⅡ 、TⅢ),分別靶向 Annexin-1基因的 240-260(SⅠ),435-455(SⅡ)和 506-526(SⅢ)區(qū)域(表 1)。另外,根據(jù)轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)學(xué)變化,設(shè)計與 TI(240 siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機對照 siRNA(240c1,240c2)做為陰性對照,用 Blast驗證隨機序列與基因庫中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(β-actin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為 RNA干擾實驗的陽性對照。設(shè)計的正反義寡核苷酸模板 3′端均加上 T7啟動子引物 5′CCTGTCTC3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 設(shè)計了 1對 Annexin-1的引物,序列:上 游:5′-GACCACCTCAACTCAAGGAC-3′, 下 游:5′-AGGAAGCTGGATGAAGAGAC-3′,擴增片段長度 546 bp,同時設(shè)計了 1對管家基因 β-actin的引物作為內(nèi)參照,序列:上游:5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′, 下 游:5′-AGAGGTCCTTACG-GATGTCAACG-3′,擴增片段長度為 290 bp,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 常規(guī) RPMI1640培養(yǎng),至轉(zhuǎn)染前夜,細胞培養(yǎng)液更換為用無血清和無抗生素的 IMDM,置于 37℃、5%CO2孵箱,轉(zhuǎn)染后用 20%胎牛血清(FBS)IMDM培養(yǎng)液,按常規(guī)方法培養(yǎng),取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。用 Opti-MEMⅠ轉(zhuǎn)染液及脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑,按試劑盒說明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,分別將 3對 siRNA和陽性對照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNA-neg)以 400 nmol/L的終濃度加入細胞培養(yǎng)液,孵育 24、48、72 h后收獲細胞進行檢測。實驗重復(fù) 3次。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后膀胱癌 T24細胞 Annexin-1 mRNA的表達水平 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA,用 2μg總 RNA進行 cDNA的合成,半定量 RT-PCR方法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后不同時間點 24、48、72 h細胞中 Annexin-1 mRNA表達水平的變化,β-actin作內(nèi)對照。PCR擴增條件Annexin-1:95℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 40 s,58℃復(fù)性 1 min,72℃延伸1 min,共 33個循環(huán);72℃延伸 10 min。 β-actin:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性 1 min,63℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,共 30個循環(huán);72℃延伸 10 min。取適量 PCR擴增產(chǎn)物,在 2%瓊脂糖凝膠電泳(80V,25min),溴化乙啶(EB)染色,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。用凝膠成像分析儀進行半定量分析,以檢測基因β-actin的相對亮度表示該基因 mRNA的相對表達量。

表1 Nucleotide sequences of the Annexin-1靶向siRNA的序列

1.2.5 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染前后膀胱癌T24細胞 Annexin-1蛋白的表達 取狀態(tài)良好對數(shù)生長期細胞 5×106個,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 2遍,于冰上加冷的細胞裂解液,制備細胞總蛋白,Lowry法蛋白定量。將樣品置于 5×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液中,100℃加熱 10 min使蛋白質(zhì)變性,聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白免疫法(Western)印記,按 0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量稀釋的抗體,于搖床上室溫 2 h,PBS漂洗濾膜3次,加入辣根過氧化物酶標記二抗,將漂洗過的硝酸纖維素膜移至上述底物溶液中,輕輕搖動,蛋白條帶的顏色達到要求,即用水沖洗,濾紙吸干,拍攝膜的照片,結(jié)果保存。內(nèi)參對照使用小鼠抗人 β-actin(稀釋度為 1∶10 000),以保證上樣量一致。

1.2.6 siRNA和脂質(zhì)體的細胞毒性檢測 細胞用無血清和無抗生素的培養(yǎng)液洗滌重懸,每孔 2×104加入 96孔板。分別加入用 Opti-MEMⅠ稀釋的 siRNA(終濃度為 100 nmol/L)或 Lipofectamine2000(終濃度為 2 ml/L),6 h后加入含 20%血清的培養(yǎng)液補足血清,72h后分別加入5 mg/ml的噻唑藍(MTT),每孔20μl,37℃置 4h,棄上清,每孔加入 100μl二甲基亞砜(DMSO),待完全溶解后,測定其在 570nm的吸光度,并計算細胞存活率。對照孔細胞中加入等量的 Opti-MEMⅠ代替脂質(zhì)體或SiRNA,其余培養(yǎng)條件與處理組相同。

1.2.7 MTT法檢測細胞對順鉑敏感性的變化 取對數(shù)生長期的細胞,用含有 10%血清的RMPI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105/ml,接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔 180μl,在 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng) 24h。分組加藥,每個濃度設(shè)3個平行孔,處理組加不同濃度的順鉑,陰性對照組加等體積的生理鹽水,使每孔終體積為 200μl,培養(yǎng) 68 h后,每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4h,2 000 r/min離心 10min,棄上清,每孔加入 100μl DMSO,振蕩至沉淀完全溶解,在酶標儀上檢測570nm光密度(OD)值。按以下公式計算腫瘤細胞生長抑制率。以同一藥物的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50,即細胞存活率減少 50%時的藥物劑量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,兩組均數(shù)間比較采用 t檢驗,多組均數(shù)間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1mRNA表達的影響經(jīng) AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)軟件分析,以 40nmol/L濃度轉(zhuǎn)染 T24細胞 24 h后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組 mRNA表達水平明顯降低,在 24h下調(diào)(80.63±0.24)%,(t=474.3,P=0.001);在48 h下調(diào)(38.9±0.85)%,(t=64.833,P=0.01),72 h恢復(fù)正常。見圖 1。

2.2 siRNA對膀胱癌 T24細胞Annexin-1蛋白表達的影響與隨機對照的 siRNA相比,靶向Annexin-1的 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)Annexin-1蛋白表達明顯下降,并且與 RT-PCR結(jié)果一致。見圖 2。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染后膀胱癌 T24細胞對順鉑敏感性的變化MTT法顯示,以 40nmol/L濃度轉(zhuǎn)染 T24細胞 24 h后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組細胞對順鉑的 IC50值(μg/ml)均有不同程度的下降,從30.27下降到 7.81、6.94和 5.75,順鉑敏感性顯著增加(P＜0.05)。同時以不同濃度順鉑培養(yǎng)后細胞生存率亦明顯下降,與對照組比較差異顯著(P＜0.05),見圖 3。

2.4 siRNA和脂質(zhì)體的細胞毒性檢測結(jié)果 T24細胞經(jīng)靶向Annexin-1基因的 siRNA或 oligolipofectamine處理后計算細胞存活率,與未處理的 T24細胞相比,沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,顯示siRNA及脂質(zhì)體本身在實驗條件下對細胞基本沒有毒性作用。

圖1 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1mRNA表達的影響

圖2 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1蛋白表達的影響

圖3 不同濃度順鉑培養(yǎng)后T 24細胞生存率變化

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一,在美國其發(fā)病率居全身各部位腫瘤的第四位,在我國則排至第八位,近年來發(fā)病率呈上升趨勢〔3〕。目前,就 Annexin-1的表達缺失是否與膀胱癌細胞的異常增殖潛力相關(guān)以及對化療藥物的敏感性尚未明了。

RNA干擾是由雙鏈 RNA分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達使其沉默的過程,是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法,此時啟動子是活躍的,靶基因能夠被轉(zhuǎn)錄,但不能正常累積mRNA。其優(yōu)點首先表現(xiàn)在 siRNA只引起與其同源的mRNA降解,而其他基因的表達不受影響,因此具有高度的序列專一性。實驗證實,導(dǎo)入細胞的 siRNA只能引起同源基因表達的抑制,而無關(guān)基因不受影響〔4〕。在 siRNA序列中配對的 19～21nt中如果只改變一個核苷酸,就可以使該 siRNA序列不對靶 mRNA起作用,證明RNA干擾有明顯的特異性。其次RNA干擾是通過自身放大機制來發(fā)揮作用,極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表達,因此與反義寡核苷酸等基因封閉技術(shù)相比,具有高效性〔5〕。另外 RNA干擾操作簡便快捷,利用RNA干擾技術(shù),甚至可以在 1 w之內(nèi)關(guān)閉 10個基因。

Elbashir等〔6〕首次報道 siRNA在哺乳動物體外培養(yǎng)細胞中能夠成功的誘導(dǎo)特異基因受阻。作為一種有效抑制基因表達的方法,RNA干擾技術(shù)在近幾年被廣泛用于基因的功能研究。雙鏈 siRNA的合成是進行 RNAi研究的關(guān)鍵〔7〕,本研究中采取了體外轉(zhuǎn)錄法,即在噬菌體RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下,以連有噬菌體啟動子的線性DNA為模板,直接合成出特異雙鏈siRNA。RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNA的關(guān)鍵酶,除了在本實驗中用到的 T7 RNA聚合酶,其他通用的 RNA聚合酶還有 T3、SP6 RNA聚合酶,它們均是以 DNA為模板的RNA聚合酶。DNA模板必須連有特異的啟動子序列,啟動子區(qū)域是噬菌體 RNA聚合酶結(jié)合和 RNA開始合成的部位,因此本實驗在設(shè)計寡核苷酸模板的時候,3′端均加上T7啟動子引物 5′CCTGTCTC3′。在 RNA聚合酶結(jié)合到雙鏈 DNA啟動子后,聚合酶分開雙鏈 DNA模板,并以 3′～5′鏈作為模板合成出互補的5′～3′RNA鏈,合成出的正反義 RNA鏈經(jīng)雜交即可得雙鏈RNA。在本研究中,以 AA開頭針對 597 bp的 Annexin-1 cds區(qū)的靶序列共有 26個,其中 GC堿基含量在 50%以下的有 25個,對其進行 Blast分析,最終選擇了 240～260(SⅠ),435～455(SⅡ)和 506～526(SⅢ)的 3段序列,其中 SⅠ siRNA靶序列的GC含量為 43.9%,SⅡ siRNA靶序列的 GC含量為 39.2%,SⅢsiRNA靶序列的 GC含量為 41.2%。結(jié)果表明 3段 siRNA序列都有抑制 Annexin-1基因表達的作用,但是SⅡ siRNA抑制作用要更強一些。通過研究 3對不同的靶向干擾序列和1對陰性對照序列,發(fā)現(xiàn)在mRNA水平 3對靶向序列均可抑制 Annexin-1的表達,在蛋白水平也獲得較高的抑制效果。

本研究還提示轉(zhuǎn)染 T24細胞后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組細胞對順鉑的 IC50值(μg/ml)分別下降了 3.8、4.4和 5.3倍,順鉑敏感性顯著增加。通過干擾 Annexin-1基因,可以改變膀胱癌 T24細胞生存能力,對照組在不同的順鉑濃度下(20～80μg/ml)生存率分別為 94.54%、87.22%、58.39%和 42.83%,經(jīng) 3個 siRNA干擾后生存率明顯下降。膀胱癌 T24細胞是順鉑耐藥的細胞〔8〕,siRNA干擾后對順鉑敏感性增加,從而為順鉑耐藥的治療提供了一個很好的思路。

1 Silistino-Souza R,Rodrigues-Lisoni FC,Cury PM,et al.Annexin-1:differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕.Int J Cancer,2007;120(12):2582-9.

2 Ang EZ,Nguyen HT,Sim HL,et al.Annexin-1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF-7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res,2009;7(2):266-74.

3 Baffa R,Letko J,Mc Clang C,et al.Molecular genetics of bladder cancer:targets for diagnosis and therapy〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2006;25(2):145-60.

4 Dalzell JJ,Mc Master S,Fleming CC,et al.Short interfering RNA-mediated gene silencing in Globodera pallida and Meloidogyne incognita infective stage juveniles〔J〕.Int J Parasitol,2010;40(1):91-100.

5 Pal-Bhadra M,Bhadra U,Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell,2002;9(2):315-27.

6 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interfernce in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411(6836):494-8.

7 Berezhna SY,Supekova L,Supek F,et al.siRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA,2006;103(20):7682-7.

8 Konstantakou EG,Voutsinas GE,Karkoulis PK,et al.Human bladder cancer cells undergo cisplatin-induced apoptosis that is associated with p53-dependent and p 53-independent responses〔J〕.Int JOncol,2009;35(2):401-16.