陸洪軍 王淑秋 劉振平 任翊華

(佳木斯大學第一附屬醫(yī)院普通外科,黑龍江 佳木斯 154002)

在腫瘤的生物學行為中,浸潤和轉(zhuǎn)移是最重要的特征,也是一些實質(zhì)性腫瘤難以治愈的原因。盡管外科手術治療、放射治療和化學治療日益完善,但如何早期診斷,及時正確治療,抑制惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移,提高患者的生存率已成為當今腫瘤防治的重要課題。研究證實,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是包括結(jié)腸癌在內(nèi)的許多腫瘤細胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機制。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過與E-cadherin啟動子區(qū)的 E-盒(E-box)結(jié)合,下調(diào) E-cadherin的表達,進而誘導 EMT的發(fā)生,促使腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移〔1〕。本文旨在探討轉(zhuǎn)錄因子 Snail在結(jié)腸癌中的表達,以判定該轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 2007年1月至 2008年 8月,在本院行根治性手術的大腸癌患者 68例,男 42例,女 26例;年齡 32～75歲(中位年齡 57.3歲);術中留取標本。所有病例術前均未接受化療及放療。①腫瘤部位:左半結(jié)腸 38例、右半結(jié)腸 30例;②腫瘤大小:≤5cm者 48例、＞5cm者20例。③組織學分型:乳頭狀腺癌 4例,管狀腺癌 48例,黏液腺癌 11例,印戒細胞癌 5例;④分化程度:高分化腺癌 24例,中分化腺癌 30例,低分化腺癌 14例;⑤浸潤深度:未及漿膜層 25例,浸及漿膜層 43例;⑥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有轉(zhuǎn)移 18例,無轉(zhuǎn)移 50例;⑦Dukes分期:A期 32例,B期 20例,C期 11例,D期 5例。另取 20例結(jié)腸癌正常腸段的腸黏膜(經(jīng)病理檢查無異常)作對照。

所用試劑為兔抗人Snail多克隆抗體(購自 Santa Cruz公司);逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(購自 Promega公司);Trizol試劑(購自美國寶生公司)。

1.2 方法

1.2.1 Snail mRNA檢測 按 Trizol試劑盒說明提取總 RNA。用紫外分光光度儀測定 A 260/A 280,比值在 1.9～2.0之間,計算 RNA含量。引物設計:(1)上游引物:5′-AATCGGAAGCCTAACTACAG-3′;下 游引物 :5′-GGAACAGGCTGAAGTAGAG-3′(擴增長度 320 bp)。 (2)GAPDH:上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′;下 游 引 物:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(擴增長度 452 bp,為內(nèi)參照)。逆轉(zhuǎn)錄反應按試劑盒操作。RT-PCR產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.2.2 Snail蛋白的檢測 Western印跡法?？偟鞍滋崛?4℃收集細胞,每孔加入 100μl細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH 8.0 EDTA、1%NP40、0.05%PMSF、2μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin),超聲破碎,4℃12 000 r/min離心 5 min,收集上清液。細胞核蛋白提取:參照文獻方法〔2,3〕,略改動。蛋白質(zhì)樣品與等體積 2×上樣 buffer混勻,煮沸 5min,紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度。按蛋白含量測定結(jié)果每孔上樣 50μg,12.5%SDS-PAGE分離樣品。低溫100V 3 h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,用封閉液(5%脫脂奶粉、3%BSA、0.02%Tween-20溶于 PBS)室溫封閉 2 h,將膜與溶于封閉液中的一抗(兔抗人 Snail多克隆抗體 1∶500)室溫孵育2 h,PBS洗 5 min×3次,TBS洗5 min×4次,將膜與溶于二抗稀釋液 (5%脫脂奶粉、0.02%Tween-20、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5)中的二抗室溫孵育 1 h,TBS洗5 min×4次,將膜裝入可熱接封的塑料袋中,加入 ECL試劑,暗室曝光、顯影、定影,對 X光底片拍照保存。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示,應用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。各組Snail mRNA相對水平經(jīng)方差齊性檢驗后采用 Student-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌組織Snail mRNA表達與臨床病理因素的關系Snail mRNA在結(jié)腸癌中的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位及大小無關(P＞0.05),而與腫瘤浸潤深度、組織學分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 Dukes分期均有關。Snail mRNA在黏液癌(印戒細胞癌、黏液腺癌)、低分化、浸及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及處于 Dukes C+D期的結(jié)腸癌組織中表達均明顯增高(P＜0.05,P＜0.001)。Snail與結(jié)腸癌腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關。見表 1。

表1 結(jié)腸癌組織Snail mRNA表達指數(shù)與臨床病理因素間的關系(x±s)

2.2 結(jié)腸癌和癌旁組織 Snail mRNA及其蛋白的表達 結(jié)腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織中均有 Snail mRNA表達,但與正常結(jié)腸上皮相比較,結(jié)腸癌 Snail mRNA的表達升高(P＜0.01)。見表 2和圖 1。結(jié)腸癌 Snail P30條帶較正常對照組加寬加深,應用Chen Image 5500v2.03軟件計算蛋白平均灰度值,結(jié)果顯示 Snail蛋白表達與正常結(jié)腸上皮相比較,有顯著差異(P＜0.001)。見表 2和圖 2。

圖1 Snail m RNA的表達

表2 結(jié)腸癌和癌旁正常腸黏膜組織中Snail m RNA及其蛋白的表達(x±s)

圖2 Snail P30的表達

3 討 論

EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,是許多腫瘤細胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機制〔4〕。EMT在個體胚胎發(fā)育、組織形成、傷口愈合和慢性炎癥中,均發(fā)揮著重要作用〔5〕。研究證實,Snail參與了包括乳腺癌、胃癌和鱗狀上皮細胞癌在內(nèi)的某些腫瘤細胞發(fā)生EMT并促進其侵襲轉(zhuǎn)移〔6～8〕。 Snail可使細胞 E-鈣黏素及 α、β 、γ-連環(huán)素等上皮細胞標志物表達降低或消失,可表達成纖維細胞特異性蛋白-1、N-連環(huán)素等多種間充質(zhì)細胞標志蛋白,且可增強腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在一定條件下逆轉(zhuǎn) EMT表型時,就可以降低腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力并延長荷瘤動物的生存期。

Snail通過以下機制引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移:①作用于啟動子上的 E-boxes連接基序,直接抑制 E-cadherin、claudins、occludins等上皮黏附位點成分的轉(zhuǎn)錄,使細胞間黏附紊亂;②抑制ABLIM-l、EPLIN等細胞骨架成分表達,使細胞骨架重組;③促進基質(zhì)金屬蛋白酶表達,降解基質(zhì)以促進細胞侵襲。研究證實,Snail引起的EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,但不是惟一的,免疫抑制也起著一定作用〔9〕。

本研究表明:(1)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織Snail mRNA及其蛋白表達間存在差異:結(jié)腸癌組織 Snail mRNA及其蛋白表達增加,提示Snail的高表達是結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的重要事件。(2)Snail mRNA及其蛋白的表達與組織學類型、分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期均有關:在黏液癌、低分化、侵及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和處于 Dukes C+D期的結(jié)腸癌中 Snail mRNA及其蛋白表達明顯升高,同樣提示 Snail的表達增加可以評價結(jié)腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。

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3 Dignam JD,Lebovtz RM,Roeder RG.Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei〔J〕.Nucleic Acids Res,1983;11(5):1475-89.

4 Thomson S,Buck E,Petti F,et al.Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition〔J〕.Cancer Res,2005;65(20):9455-62.

5 Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease:old viewsand new perspectives〔J〕.Int J Dev Biol,2008;10.

6 C?me C,Magnino F,Bibeau F,et al.Snail and slug play distinct roles during breast carcinoma progression〔J〕.Clin Cancer Res,2006;12(18):5395-402.

7 Castro AC,Rosivatz E,Schott C,et al.Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and Snail in the downregulation of E-cadherin〔J〕.JPathol,2007;211(5):507-15.

8 Usami Y,Satake S,Nakayama F,et al.Snail-associated epithelial-mesenchymal transition promotes oesophageal squamous cell carcinomamortality and progression〔J〕.J Pathol,2008;215(3):330-9.

9 Kudo-Saito C,Shirako H,Takeuchi T,et al.Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells〔J〕.Cancer Cell,2009;15(3):195-206.