盧 冬 陸小嬋 覃志堅 韋世革

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科,廣西 百色 533000)

過氧化物酶體增生激活型受體 γ(PPARγ)可在體內多種組織中表達,參與體內多種生理和病理生理過程。體外細胞培養(yǎng)研究表明,PPARγ的激活可以抑制周圍血淋巴細胞對炎性血細胞因子的分泌。研究發(fā)現(xiàn) PPARγ的特異性配體可以通過調節(jié)炎性反應而減輕實驗性心肌缺血組織的病理損傷〔1〕。本研究旨在觀察腦梗死患者周圍血淋巴細胞中 PPARγmRNA的表達變化及其與血清 C反應蛋白(CRP)水平的相關性,探討PPARγ在腦缺血炎性病理損傷中的可能作用機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2005年 1月至 2008年 7月在我院神經內科就診的發(fā)病 3 d以內的腦梗死患者。所有患者均符合 1995年全國第四屆腦血管病學術會議制定的診斷標準〔2〕。并且經 CT證實,共收集符合入選條件患者 64例,排除有心肌梗死、周圍血管栓塞疾病、腫瘤患者,以及發(fā)病前 2 w有炎性病變史或入院時發(fā)生感染性疾病者(如嚴重的上呼吸道感染、肺炎、高熱等)、有嚴重的肝腎功能不全患者等。正常對照組來自同期健康體檢者,除具備以上排除標準外還均需詢問并證實無心腦血管病史,共 60例。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 抽清晨空腹肘靜脈肝素抗凝血 6 ml,淋巴細胞分離液提取單個核細胞后,采用吸附柱過濾法分離淋巴細胞,經磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗滌后加 1 ml Trizol,震勻,室溫靜置 8 min,后經氯仿分層,異丙醇沉淀和 75%的焦碳酸二乙酯(DEPC)酒精洗滌干燥后,將所得 RNA溶液溶于 0.1%DEPC水溶液中,4℃ 12 000r/min離心 15min,吸取上清液到新的 1.5 ml菌種保存管(EP管)中,加等體積異丙醇,4℃12 000 r/min離心 10 min,棄上清,加 DEPC及新配制的 75%乙醇1 ml洗滌總 RNA,4℃ 7 500r/min離心 5min,棄去上清液,瞬時離心后用小吸管吸盡殘留液體,置冰浴盒內,自然晾干。

1.2.2 cDNA的合成 取 RNA 2μg,加 Olig(dT)18μl,于 60℃水浴 10 min,再放冰上驟冷,而后加 RNA酶抑制劑、M-MulL V逆轉錄酶等,60℃孵育 60 min,95℃滅活酶 5 min,最后將將逆轉錄產物用于 PCR擴增。

1.2.3 PCR擴增 取上述合成的 cDNA 2μl加入 2.5 U的Taq DNA多聚酶、10×PCR緩沖液、10 mmol dNTP混合物、25 mmol MgCl2及目的引物和內對照,PPARγ的引物序列為 5′-CTTCACTGATACACTGTCTGC-3′,長 度 為 207 bp,內 參 物 為(GAPD),長度為 306bp。引物均由上海生物工程服務有限公司合成。于 PCR儀內擴增 31個循環(huán),反應終末 72℃延伸10 min,最后 PCR產物于含有溴化乙錠(EB)的 1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.4 血清CRP測定 抽空腹靜脈血 2 ml(與提 RNA的血液同時抽取),離心取血清,7060全自動生化分析儀用免疫透射比濁法測定 CRP含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數據輸入 SPSS10.0數據包進行統(tǒng)計分析,構成比 χ2檢驗,獨立樣本間的比較采用 t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組一般情況資料對比 腦梗死組除了收縮壓和白細胞數較對照組明顯升高外(P＜0.01),其余兩組在年齡、吸煙、體重指數各項指標兩組間無顯著意義(P＞0.05)。見表 1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組 PPARγmRNA、血清CRP水平比較 將 PCR電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)測量,計算PPARγmRNA的相對比值。腦梗死組 PPARγmRNA表達明顯低于正常對照組(P＜0.01),腦梗死組 CRP水平明顯高于正常對照組(P＜0.01)。見表 2。

表2 兩組 PPARγmRNA及 CRP表達比較(x±s)

2.3 腦梗死患者PPARγmRNA和血清CRP的相關性分析將周圍血淋巴細胞 PPARγmRNA表達和血清 CRP水平進行相關性分析,PPARγmRNA表達越低,CRP水平越高,二者呈負相關(r=-0.539,P＜0.01)。

3 討 論

PPARγ作為一種細胞核受體,通過位于靶基因啟動子中的過氧化小體增殖物反應元件(PPRE)結合后調控靶基因的轉錄。CRP作為循環(huán)中的急性反應時相炎癥蛋白,在各種急性炎癥、組織損傷、心肌梗死、手術創(chuàng)傷等疾病發(fā)作后數小時迅速升高,并有成倍增長之勢。病變好轉時,又迅速降至正常,其升高幅度與感染的程度呈正相關。在患者疾病發(fā)作時,CRP可早于WBC而上升,恢復正常也很快,故具有極高的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn),腦梗死患者發(fā)病早期 PPARγmRNA表達明顯下調,同時 WBC及 CRP較較正常對照組顯著增高,且PPARγmRNA表達與CRP含量呈負相關。提示PPARγ可能參與了腦缺血的病理過程,通過調節(jié) CRP路徑參與腦梗死病理方面的炎癥反應,引起的組織損傷和促進血栓形成。

PPARγ激活后可經抑制包括淋巴細胞和單核巨噬細胞在內的炎癥細胞的免疫活性,其特異性配體通過調節(jié)炎性反應而減輕缺血性病理損傷。Atushi〔1〕研究發(fā)現(xiàn),PPARγ的特異性激活配體(BRL-49653)能夠減輕腸缺血損傷外,Wayman〔3〕等通過心肌缺血再灌注模型實驗同樣證實了 PPARγ激活劑能夠減輕心肌梗死面積,降低心肌病理損傷,有利于心肌功能的恢復。目前認為,PPARγ所具有的抗缺血性損傷作用主要和其激活后抑制了炎性細胞分泌細胞間黏附分子-1(ICAM-1),腫瘤壞死因子(TNF-α),白細胞介素(IL-8),內皮細胞黏附因子(CD18),肝組織細胞黏附因子-1(MCP-1),基質金屬蛋白酶(MMP-2)等細胞因子降低其活性有關。有腦缺血時,淋巴細胞和單巨噬細胞均存在免疫激活現(xiàn)象,并且上述炎性相關因子表達增加后導致腦缺血炎性損傷。

大規(guī)模前瞻性的臨床試驗顯示CRP的水平增高是不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化疾病發(fā)生的危險信號,也預示著缺血性腦梗死患者的預后不良。越來越多的證據表明血清CRP濃度升高與腦梗死的關系,認為其與高血壓、糖尿病一樣,是腦梗死預后的獨立危險因素〔4,5〕。研究顯示 CRP水平與急性腦梗死的發(fā)生、嚴重程度及預后呈正相關〔6〕。腦梗死病例中 CRP有顯著升高的病例傾向于大面積的梗死及更高的致殘率,而 CRP不高的病例則傾向于小面積的梗死〔7〕。本研究 64例患者 CRP濃度比正常對照組顯著增高,表明在腦梗死早期,急性時相反應炎癥蛋白 CRP是一項比較敏感的檢驗指標,有著很好的陰性預測意義。

綜上,推測腦缺血時 PPARγ表達下調可能參與了腦缺血炎性病理損傷,PPARγ表達下調是腦缺血后炎性反應的原因,并且其下調的幅度與 CRP呈負相關。既然在腦梗死中存在PPARγ表達變化,并且有可能導致腦缺血的炎性損傷,所以從理論上認為對腦梗死患者給予外源性的PPARγ激活配體可減輕腦缺血的炎性損傷。

1 Atushi N,Koichiro W,Hiroshi M,et al.Endogenous PPARgamma mediates anti-inflammatory activity in murine ischemia-reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2001;120(2):460-9.

2 全國第 4次腦血管病學術會議.腦卒中患者臨床神經功能缺損程度評分標準(1995)〔J〕.中華神經科雜志,1996;29(6):381-3.

3 Wayman NS,Hattori Y,Mc Donald,et al.Ligands of the peroxisome proliferator-activated receptors(PPAR-gamma and PPAR-alpha)reduce my-ocardial infarct size〔J〕.FASEB J,2002;16(9):1027-40.

4 Rost NS,Wolf PA,Kase CS,et al.Plasma concentration of C-reactive protein and risk of ischemic stroke and transient ischemic attack the Framingham Study〔J〕.Stroke,2001;32(11):2575-9.

5 Price CJS,Warburton EA,Menon DK.Human cellular inflammation in the pathology of acute cerebral ischaemia〔J〕.JNeurol Neurosurg Psychiatry,2003;74:1476-84.

6 彭 軍,章軍建.急性腦梗死患者 C-反應蛋白水平變化〔J〕.卒中與神經疾病,2006;13(1):45-7.

7 張微微,周小英,黃勇華.不同類型腦梗死患者血清 C-反應蛋白的檢測及臨床意義〔J〕.中華檢驗醫(yī)學雜志,2004;27(11):781-3.