田雪蓮， 陸偉東， 丁 偉**， 卯 霞， 田雪珊， 張 軍

（曲靖師范學(xué)院云貴高原生物多樣性研究所，云南 曲靖 655011；2.曲靖市疾控中心，云南 曲靖 655000）

蛹蟲草Cordyceps militaris(Fr.)Link，又名北冬蟲夏草，為子囊菌亞門 （Ascomycotina）、球殼菌目 （Sphaeriales）、 麥角菌科 （Clavicipitaceae）、 蟲草屬 （Cordyceps）真菌[1]，是蟲草屬的模式種，是蛹草擬青霉（Peacilomyces militaris）的有性型[2]。野生蛹蟲草分布于我國東北、華北、西南地區(qū)的10多個(gè)省 （市）、自治區(qū)。與冬蟲夏草相比，二者無根本性質(zhì)差異，均含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、SOD、粗脂肪、粗蛋白、氨基酸、無機(jī)元素等且含量都很豐富，而且有些成分高于冬蟲夏草[3]，是冬蟲夏草的最佳替代品。通過對1株轉(zhuǎn)管17次，且出現(xiàn)野生性狀退化的菌株P(guān)m0217F進(jìn)行紫外誘變，比較不同誘變菌株之間的生物學(xué)特性，以期為生產(chǎn)中改良菌株和菌株篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Pm0217F菌株是Pm02菌株的第17代傳代菌株。該菌株已出現(xiàn)明顯的菌種退化現(xiàn)象。菌株培養(yǎng)14 d菌落白色，背面出現(xiàn)暗紫色。人工代料培育不形成子實(shí)體原基，在培養(yǎng)基表面形成1層菌膜。

1.1.2 設(shè)備

ZHWY-2102恒溫振蕩器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LRH-150-G光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；紫外可見分光光度儀，安捷倫科技6010；恒溫水浴鍋，江蘇金壇中大儀器廠；電熱恒溫干燥箱，成都天宇實(shí)驗(yàn)設(shè)備責(zé)任有限公司；不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

沙氏液體搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖2%、麥芽糖0.5%、酵母浸膏0.5%、蛋白胨1%，pH自然；沙氏瓊脂斜面、平板培養(yǎng)基：同前，加瓊脂2%。

1.2.2 蛹蟲草菌株的紫外線誘變

分別取1 mL菌懸液置于9 cm倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布法涂勻。然后將其放在功率為30 W的紫外燈下，垂直距離40 cm處進(jìn)行誘變，誘變時(shí)間梯度為0 s、30 s、60 s、90 s、120 s。誘變結(jié)束后將各培養(yǎng)皿倒置于26℃培養(yǎng)箱里避光培養(yǎng)7 d，并進(jìn)行純培養(yǎng)，獲得誘變菌株。誘變菌株編號分別為A、B、C、D、E。

1.2.3 誘變后各菌株的菌落特征及生長速率變化

將上述經(jīng)過紫外誘變后的菌種用點(diǎn)接法接種到平面培養(yǎng)基上，每菌株做3個(gè)平行，從第48小時(shí)起，每隔48 h測量1次菌落的直徑，并根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)繪制出對應(yīng)的生長曲線。并于第14天進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、描述和記錄。

1.2.4 扦片培養(yǎng)顯微觀察

將扦片培養(yǎng)了7 d的各菌株用乳酸石碳酸棉藍(lán)染色劑染色后觀察，分別隨機(jī)的選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)誘變后各菌株大孢子千分率、分生孢子不同聚集類型的比例。

1.2.5 蛹蟲草誘變后的蟲草菌素含量的測定

將上述各紫外線誘變株分別接種到液體培養(yǎng)基中，接種量1 mL，發(fā)酵液為 80 mL·瓶－1，每菌株3個(gè)平行，于26℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液和菌絲體一起轉(zhuǎn)置離心管中，2 500 r·min－1離心10 min，進(jìn)行菌液分離，去其上清液，用雙蒸水沖洗菌絲，再離心，如此重復(fù)3次，得到基本無培養(yǎng)基的菌絲體，將其置于鼓風(fēng)干燥箱中，55℃烘至恒重，研磨，過60目篩，得菌絲粉。

精密稱取上述各待測樣品粉末0.5 g置于試管中，加入20%乙醇3 mL，水浴30 min，定容，稀釋，過濾，得待測樣品液，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

1.2.6 蟲草菌素紫外分光光度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)蟲草菌素的最大吸收波長為259 nm，在此波長下，繪制蟲草菌素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)見表1。

表1 蟲草菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

將表1數(shù)據(jù)即蟲草菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)Excel軟件分析，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，其回歸方程如下：

式中：C為蟲草菌素對照品濃度 （μg·mL－1）；A為259 nm下吸光度。

方程表明， 蟲草菌素在 5 μg·mL－1～30 μg·mL－1范圍內(nèi)，與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 各誘變株的菌落特征差異

A：菌落扁平，邊緣整齊，白色，菌絲不發(fā)達(dá)；B：菌落扁平，邊緣較整齊，白色，菌絲較發(fā)達(dá)；C：菌落扁平，邊緣整齊，略顯淡黃色，菌絲發(fā)達(dá)；D：菌落中部略隆起，邊緣較整齊，白色，菌絲不發(fā)達(dá)；E：菌落扁平，邊緣較整齊，白色，菌絲不發(fā)達(dá)。

與該菌株的低代傳代菌株相比，誘變后的菌株只有C菌株出現(xiàn)了淡黃色，與低代菌株相似。

2.2 誘變后各菌株的生長速率變化分析

紫外線照射后避光培養(yǎng)的菌落生長狀況見表2。

表2 紫外線照射后避光培養(yǎng)的菌落生長狀況

通過回歸方程可得各誘變菌株的生長速率，從表2可以看出各誘變株在相同條件下培養(yǎng)14 d后，其長出的菌落直徑有差異，通過無重復(fù)雙因素方差分析可得：F時(shí)間＝181.8517＞Fα＝2.508189， 拒絕原假設(shè) H0， 說明生長時(shí)間對菌株的生長有顯著影響； F株間＝25.04269＞Fα＝2.7763， 拒絕原假設(shè)H0，說明不同菌株間的生長速率有顯著差異。

2.3 扦片培養(yǎng)顯微觀察誘變后各菌株的孢子數(shù)量、類型及比例分析

顯微觀察中發(fā)現(xiàn)蛹草擬青霉的分生孢子單孢，透明，光滑。從形狀上看有兩大類，一類是近球形，直徑約為1.5 μm～2.0 μm 的小孢子； 另一類是孢子鏈頂部的分生孢子， 呈柱狀或長橢圓形， 大小約為 （0.8～1.2）μm × （3～7）μm。分生孢子常呈迭瓦狀排列或聚集成疏松的孢子頭。

2.3.1 各誘變株間大分生孢子大千分率比較

通過扦片觀察計(jì)數(shù)，可得10個(gè)視野下大小孢子數(shù)量，見表3。大孢子數(shù)量較少，可通過統(tǒng)計(jì)大孢子的千分率來進(jìn)行分析，見圖2。

圖2 大孢子千分率

表3 10個(gè)視野下大小孢子數(shù)量

從圖2可以看出，不同誘變菌株間大孢子的千分率不同，其中誘變時(shí)間為60 s的C菌株，其大孢子千分率最大，且大孢子千分率隨紫外線照射時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

2.3.2 各誘變株間分生孢子聚集類型比較

不同誘變株間頭狀聚集及疊瓦狀聚集方式的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 4。

表4 不同誘變株間頭狀聚集及疊瓦狀聚集方式的統(tǒng)計(jì)

從表4可以看出，隨著誘變時(shí)間的增加，孢子頭狀聚集方式的比例先呈下降趨勢后呈上升趨勢。當(dāng)誘變時(shí)間為60 s時(shí)孢子頭狀聚集方式的比例最低。而孢子疊瓦狀聚集方式的比例與孢子頭狀聚集方式的比例變化正好相反。

2.4 不同紫外線照射時(shí)間對Pm0217F菌株蟲草菌素含量影響

用紫外分析儀測得各菌株發(fā)酵培養(yǎng)菌絲中蟲草素百分含量，結(jié)果見表5。

表5 各誘變株菌絲中蟲草菌素百分含量

從表5可以看出，不同時(shí)間梯度的紫外誘變對Pm0217F菌株蟲草菌素的產(chǎn)量有較為明顯作用，隨著誘變時(shí)間的增加，蟲草菌素呈上升趨勢，當(dāng)誘變時(shí)間為60 s時(shí)蟲草菌素百分含量達(dá)到最大值。之后，隨著誘變時(shí)間的增加，誘變株的蟲草菌素含量又呈下降趨勢。

3 結(jié)論與討論

從5個(gè)誘變株的各生物學(xué)指標(biāo)來看，當(dāng)誘變時(shí)間為60 s時(shí)，其培養(yǎng)性狀、生長速率、次生代謝產(chǎn)物蟲草素產(chǎn)量都較其它誘變株好，因此可初步確定最佳誘變時(shí)間為60 s。另外，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步確定，大孢子比例增加，同時(shí)孢子疊瓦狀聚集方式比例也增加時(shí)，誘變菌株的蟲草菌素百分含量也相應(yīng)增加，且在培養(yǎng)性狀上與低代菌株較相似。因此可考慮在選育菌種過程中選擇大孢子比例高，且擬青霉型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)比例大的菌株，可簡化菌株篩選程序。

[1]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[2]梁宗琦.中國真菌志－第32卷蟲草屬[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[3]李楠，宋健國，劉金云，等.蛹蟲草與冬蟲夏草化學(xué)成分比較[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1995， 17(增刊)： 80－83.