高淑敏，羅春燕，劉海林

（青海省農(nóng)林科學(xué)院野生所食用菌研究室，青海 西寧 810016）

大肥蘑菇 Agaricus bitorquis(Quél.)Sacc.（雙層環(huán)傘菌）[1]，是青藏高原柴達(dá)木盆地特殊生態(tài)環(huán)境條件下的一種分類(lèi)十分重要的野生大型食用真菌[2]。因其在草原沙土中生長(zhǎng)又名柴達(dá)木沙菇、大蘑菇。其具有個(gè)體肥大、味道細(xì)嫩鮮美、菌肉具結(jié)構(gòu)緊密、含水量低、耐儲(chǔ)運(yùn)等特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)大肥蘑菇的菌絲體等生物學(xué)特性試驗(yàn)研究，確定柴達(dá)木大肥菇菌絲體適宜生長(zhǎng)溫度，為菌種制作、栽培等提供準(zhǔn)確的培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度，為高產(chǎn)栽培技術(shù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為柴達(dá)木野生大肥蘑菇，挑選菇型整齊、生長(zhǎng)健狀、發(fā)育成熟、無(wú)病蟲(chóng)害的單生菇體作為引種分離材料。采用組織分離法分離培養(yǎng)，獲得了母種，制作原種、栽培種后，進(jìn)行發(fā)酵料堆料栽培出菇試驗(yàn)。將產(chǎn)生的大肥菇子實(shí)體選擇個(gè)體肥大、菇型好、九分成熟的菇體再次進(jìn)行分離培養(yǎng)，將長(zhǎng)勢(shì)旺盛、色素沉淀少的培養(yǎng)菌落作為供試菌株進(jìn)行菌絲細(xì)胞群體適宜培養(yǎng)溫度試驗(yàn)，供試材料為馬鈴薯、瓊脂粉、葡萄糖、硫酸鎂等試劑及小麥麥麩等[3]。試驗(yàn)用培養(yǎng)皿直徑7 cm，高壓滅菌備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柴達(dá)木大肥菇菌絲生長(zhǎng)溫度及培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)

試驗(yàn)培養(yǎng)基設(shè)置為PDA培養(yǎng)基 （馬鈴薯200 g、葡萄糖 17 g、 瓊脂粉17 g， 水1 000 mL）、FPDA培養(yǎng)基 （馬鈴薯200 g、葡萄糖17 g、瓊脂粉17 g、小麥麥麩10 g，水1 000 mL）、JFPDA培養(yǎng)基 （馬鈴薯200 g、葡萄糖17 g、瓊脂粉15 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀2 g、蛋白胨3 g、維生素B110 mg，水1 000 mL）等3種培養(yǎng)基。

麥麩水解：首先將小麥麥麩進(jìn)行水解，方法為取200 mL水加熱，加入小麥麥麩煮沸約15 min，4層紗布過(guò)濾取上清液加入到FPDA培養(yǎng)液中攪拌均勻即可。

將以上各培養(yǎng)基分別裝入300 mL三角瓶?jī)?nèi)，放置高壓滅菌容器內(nèi) （0.15 MPa，128℃），0.5 h后取出，溫度降至25℃~28℃時(shí)，分別倒入7 cm培養(yǎng)皿中制成平板培養(yǎng)面，每皿加入量為10 mL。在無(wú)菌操作工作臺(tái)上，在每個(gè)培養(yǎng)皿的中心放置一塊直徑為0.5 cm大小的大肥菇菌種塊，選擇 5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的 7個(gè)培養(yǎng)溫度梯度，間隔溫度為5℃的區(qū)域，每個(gè)溫度處理樣本數(shù)為7個(gè)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)10 d～15 d，至生長(zhǎng)速度最快處理的菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

試驗(yàn)培養(yǎng)設(shè)備為溫度范圍20℃～60℃的電動(dòng)恒溫培養(yǎng)箱，溫控誤差為±0.5℃。

測(cè)定方法為觀察測(cè)定各處理24 h～15 d，菌絲日生長(zhǎng)量的平均值 （菌塊接種后至萌發(fā)為菌塊傷期，萌發(fā)正常生長(zhǎng)后進(jìn)行常規(guī)測(cè)量）。定期測(cè)定培養(yǎng)皿平板菌落的直徑，直至長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。采用十字交叉法，每個(gè)培養(yǎng)皿分別量取2個(gè)數(shù)據(jù)，求其平均值，24 h測(cè)定1次。

1.2.2 國(guó)內(nèi)不同地區(qū)大肥菇菌株菌絲生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定青海柴達(dá)木野生大肥菇經(jīng)人工馴化后菌絲體適宜的生長(zhǎng)溫度，以及其區(qū)別于其它大肥菇菌種的差異和優(yōu)勢(shì)所在，特引進(jìn)江蘇、山東、石家莊和東北等地大肥菇進(jìn)行菌絲體生長(zhǎng)溫度比較驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)均選用FP DA培養(yǎng)基。

試驗(yàn)用大肥菇菌株來(lái)源于石家莊市創(chuàng)新食用菌研究所、山東單縣高港食用菌研究所、江蘇高郵市食用菌研究所、東北食藥用菌研究所及本省等5個(gè)菌株，進(jìn)行菌絲體培養(yǎng)溫度、生長(zhǎng)速度、培養(yǎng)基質(zhì)等生物學(xué)特性的測(cè)定。測(cè)定選擇5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃的6個(gè)培養(yǎng)溫度梯度，間隔溫度為5℃的區(qū)域，每個(gè)溫度處理樣本數(shù)為7個(gè)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)15 d～18 d，至生長(zhǎng)速度最快處理的菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

試驗(yàn)培養(yǎng)設(shè)備為溫度范圍20℃～60℃的電動(dòng)恒溫培養(yǎng)箱，溫控誤差為±0.5℃。培養(yǎng)及測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.3 不同地區(qū)大肥菇菌株原種、栽培種生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)棉籽殼和發(fā)酵牛糞 （棉籽殼60%、牛糞23%的發(fā)酵干料，加入玉米粉8%、麥草屑5%、石灰1%、石膏1%、過(guò)磷酸鈣1%、輕質(zhì)碳酸鈣1%）及麥粒和發(fā)酵干牛糞 （麥粒93%、牛糞5%、輕質(zhì)碳酸鈣1%、石灰1%，麥粒浸泡24 h后水煮30 min）等2種培養(yǎng)基，拌勻裝袋（瓶）后，放置高壓滅菌容器內(nèi) （0.15MPa，128℃），1.5 h后取出，溫度降至25℃~28℃時(shí)接入培養(yǎng)好的大肥菇試管斜面母種，接種后放置25℃下培養(yǎng)間內(nèi)進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，直至長(zhǎng)滿袋 （瓶）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴達(dá)木大肥菇最適生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)表1。

表1 不同溫度不同培養(yǎng)基大肥菇菌落直徑變化

不同溫度及培養(yǎng)基對(duì)柴達(dá)木大肥菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響不同。供試3種培養(yǎng)基都能有效地促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，但在不同溫度下培養(yǎng)皿中平板菌落直徑隨時(shí)間增長(zhǎng)的幅度產(chǎn)生差異。從表1可以看出，接種后第18天，恒溫25℃培養(yǎng)，PDA培養(yǎng)基菌落直徑最大值為5.26 cm，較JFPDA培養(yǎng)基和FPDA培養(yǎng)基的3.80 cm和4.10 cm分別高出38.4%和28.3%，可見(jiàn)，柴達(dá)木大肥菇在25℃恒溫培養(yǎng)，供試3種培養(yǎng)基都可以有效促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，PDA培養(yǎng)基在此溫度下優(yōu)于其他2種培養(yǎng)基。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在恒溫20℃下，F(xiàn)PDA培養(yǎng)基有最大菌落直徑4.28 cm，較PDA培養(yǎng)基和JFPDA培養(yǎng)基的3.46 cm和3.49 cm分別高出23.7%和22.6%，說(shuō)明在這一溫度下，F(xiàn)PDA培養(yǎng)基適宜柴達(dá)木大肥菇菌絲體的生長(zhǎng)。另外，其它3個(gè)溫度梯度相對(duì)比較低，菌絲體雖然也能緩慢生長(zhǎng)，由于溫度不適宜而不能有效促進(jìn)菌落直徑的增長(zhǎng)。

3種培養(yǎng)基都能促進(jìn)柴達(dá)木野生大肥菇平板菌落直徑的增長(zhǎng)，接種后隨時(shí)間總體呈現(xiàn)直線增長(zhǎng)的趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PDA培養(yǎng)大肥菇菌絲直徑變化趨勢(shì)

菌絲體在PDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)時(shí)，平板菌落直徑的增長(zhǎng)速度最快，幾乎每一次測(cè)量時(shí)都明顯高于其他溫度培養(yǎng)下的直徑增長(zhǎng)量。同樣，菌絲體在JFPDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)時(shí)，菌落直徑的增長(zhǎng)也表現(xiàn)出相同的優(yōu)勢(shì)，在這一溫度下直徑增長(zhǎng)曲線居首位。而在FPDA培養(yǎng)基，菌落直徑在培養(yǎng)溫度為20℃時(shí)增長(zhǎng)最快，25℃培養(yǎng)時(shí)增長(zhǎng)速度略居其次。而隨著培養(yǎng)溫度的降低，菌落直徑的增長(zhǎng)量逐漸減小。不同溫度培養(yǎng)柴達(dá)木大肥菇平板菌落直徑變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度培養(yǎng)柴達(dá)木大肥菇菌絲體生長(zhǎng)曲線

從圖2得出，在供試3種培養(yǎng)基上，柴達(dá)木大肥菇菌絲較適宜的生長(zhǎng)溫度應(yīng)該在20℃~25℃之間。

2.1.2 不同溫度培養(yǎng)下大肥菇菌落形態(tài)特征

大肥菇同一菌株在營(yíng)養(yǎng)條件發(fā)生變化時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)特征均表現(xiàn)出一定的差異，不同的培養(yǎng)溫度也會(huì)影響菌落生長(zhǎng)及形態(tài)的變化。柴達(dá)木大肥菇在FPDA培養(yǎng)基上菌絲濃密程度均勻，色澤潔白，菌落呈鐵餅狀，從接種塊中央輻射狀向四周平展；PDA培養(yǎng)基上菌絲較濃密，顏色白色，菌落中心部有隆起，四周平展，呈草帽狀；JFPDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱，前期顏色為白色，后期中部發(fā)黃，菌絲濃密成饅頭狀，向四周擴(kuò)展范圍小、速度慢。溫度偏低菌落形態(tài)緊湊，生長(zhǎng)勢(shì)弱，密度大；溫度偏高則形態(tài)相對(duì)松散，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，密度??；適宜溫度下生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，密度大。

2.2 各地大肥菇菌絲生長(zhǎng)溫度比較試驗(yàn)結(jié)果

不同溫度培養(yǎng)各地大肥菇菌絲生長(zhǎng)溫度比較試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 不同溫度培養(yǎng)各地大肥菇菌落生長(zhǎng)直徑

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難得出各地大肥菇菌絲體隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)均表現(xiàn)出逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但在不同培養(yǎng)溫度下其增長(zhǎng)幅度有明顯差異。江蘇、山東、石家莊和青海柴達(dá)木的大肥菇均在25℃培養(yǎng)時(shí)平板菌落直徑產(chǎn)生最大值，依次為3.87 cm、2.58 cm、5.38 cm和4.70 cm，東北大肥菇則在25℃培養(yǎng)時(shí)有最大值4.73 cm （表2）。結(jié)果說(shuō)明15℃以下和25℃以上的培養(yǎng)溫度，均不適宜大肥菇菌絲體的生長(zhǎng)，20℃~25℃是較適宜大肥菇菌絲體生長(zhǎng)的溫度區(qū)間。

試驗(yàn)進(jìn)一步得出，不同地區(qū)大肥菇在不同溫度下培養(yǎng)，其菌絲體生長(zhǎng)速度及趨勢(shì)差異顯著 （圖3、圖4）。在5℃培養(yǎng)條件下只有柴達(dá)木大肥菇保持緩慢生長(zhǎng)為0.35 cm，其它大肥菇菌株均受到抑制而不能生長(zhǎng)；在15℃培養(yǎng)條件下，柴達(dá)木與石家莊大肥菇增速較快，生長(zhǎng)速度達(dá)到2.08 cm；在20℃培養(yǎng)條件下，柴達(dá)木大肥菇的菌絲體增長(zhǎng)最快，其平板菌落直徑大于其它地區(qū)大肥菇；在25℃培養(yǎng)條件下，菌絲體增長(zhǎng)速度依次為青海5.26 cm、石家莊4.38 cm、江蘇3.87 cm、東北3.77 cm、山東大肥菇3.5 cm等，柴達(dá)木大肥菇在25℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)速度最快，而在30℃時(shí)僅為0.97 cm，生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)，石家莊及東北大肥菇菌絲體能正常生長(zhǎng)，菌落直徑為4.95 cm、4.73 cm。

圖3 不同溫度培養(yǎng)各地大肥菇菌落生長(zhǎng)直徑

圖4 30℃培養(yǎng)條件下各地大肥菇菌落直徑增長(zhǎng)趨勢(shì)

根據(jù)柴達(dá)木野生大肥蘑菇菌絲體在菌絲 （營(yíng)養(yǎng)）生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果分析，柴達(dá)木大肥蘑菇菌絲體適宜生長(zhǎng)溫度為20℃～25℃，30℃基本停止生長(zhǎng)，與其它地區(qū)大肥菇菌株25℃～30℃最適生長(zhǎng)溫度范圍不同，菌絲體長(zhǎng)期在0℃條件下仍能存活，與其在柴達(dá)木盆地自然生態(tài)條件下長(zhǎng)期處于低溫及巨大溫差條件相吻合，菌絲體具有耐低溫的生物學(xué)特性[5]。

2.3 不同地區(qū)大肥菇菌株原種、栽培種生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，5種大肥菇菌株試管母種均能在麥粒牛糞、棉籽殼牛糞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而形成二級(jí)種 （原種），麥粒菌種滿瓶時(shí)間均在40 d～45 d之間，無(wú)顯著差異。棉籽殼原種滿袋時(shí)間在50 d～65 d，其中，江蘇、山東、石家莊及東北大肥菇菌株發(fā)菌時(shí)間為50 d～56 d，柴達(dá)木大肥菇發(fā)菌時(shí)間較長(zhǎng)為65 d。

3 小結(jié)與討論

柴達(dá)木大肥菇菌絲在0℃條件下不能萌發(fā)但仍能存活，5℃條件培養(yǎng)下菌絲體萌發(fā)速度非常緩慢，雖有微量生長(zhǎng)，但已沒(méi)有應(yīng)用價(jià)值，15℃培養(yǎng)條件下菌絲體白、濃密，在20℃～25℃中低溫條件下生長(zhǎng)較快，在30℃溫度培養(yǎng)條件下，石家莊、江蘇、山東大肥菇菌絲體可保持正常生長(zhǎng)，而柴達(dá)木大肥菇菌絲體受到高溫抑制，生長(zhǎng)十分緩慢或停止生長(zhǎng)，菌絲體纖細(xì)稀疏、菌落呈現(xiàn)明顯不規(guī)則，色澤改變。由此可見(jiàn)，中低溫20℃~25℃是能有效促進(jìn)柴達(dá)木大肥菇菌絲體生長(zhǎng)的適宜溫度區(qū)間。這與柴達(dá)木地區(qū)地處青藏高原深處的柴達(dá)木地區(qū)常年平均氣溫低、日溫差大[4]相關(guān)，也與5月下旬日溫度范圍較低時(shí) （5℃~20℃），野生大肥蘑菇即可出菇，7月 （出菇高峰期）平均氣溫為15℃~17℃等氣候因素相吻合。

根據(jù)以上初步試驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合柴達(dá)木地區(qū)特殊氣候條件等因素分析，柴達(dá)木野生大肥蘑菇為大肥菇品種中的中低溫型菌株，這一結(jié)果為今后在青藏高原生態(tài)條件下大肥蘑菇高產(chǎn)栽培及特殊優(yōu)良菌株選育工作奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]黃年來(lái).中國(guó)食用菌百科[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[2]中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.青海經(jīng)濟(jì)植物志[M].西寧：青海人民出版社，1987.

[3]王廣民.柴達(dá)木野生大肥菇栽培研究初報(bào)[J].中國(guó)食用菌，1993，12(1)：21-22.

[4]蔡照光，黃葆寧，朗百寧，等.青藏高原草場(chǎng)及草場(chǎng)主要植物圖譜[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[5]高淑敏.青藏高原柴達(dá)木野生大肥蘑菇馴化研究初報(bào)[J].食用菌，2010(3)：24-26.