黎俊波，李楠楠，余響林，王 俊，曾 艷

(武漢工程大學(xué)綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

金屬離子熒光探針因其在環(huán)境及生物化學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用而受到關(guān)注[1].鐵離子是生命體必須的離子之一，很多細胞水平的生物及化學(xué)過程需要鐵離子的參與[2-3]，因此，鐵離子熒光探針的研究對于環(huán)境及生命科學(xué)都具有重大的意義;同時，鐵離子是順磁性的金屬離子容易淬滅熒光，當(dāng)前報道的很多鐵離子探針都是基于熒光淬滅機理[4-5]，在實際應(yīng)用中更希望探針分子與鐵離子絡(luò)合后能導(dǎo)致熒光增強而不是淬滅.近幾年報道的熒光增強的鐵離子探針還比較少[6-7]，設(shè)計合成新型的熒光增強的鐵離子探針成為研究熱點.

近年來，基于羅丹明染料的熒光探針因其可見光波長激發(fā)及原料易得而引起了科學(xué)界的關(guān)注；同時，羅丹明衍生物染料存在螺環(huán)與開環(huán)之間的平衡，當(dāng)羅丹明染料處在螺環(huán)形式時沒有熒光，而其開環(huán)狀態(tài)卻有強的熒光，利用金屬離子調(diào)節(jié)這兩種狀態(tài)的平衡進而應(yīng)用于其檢測成為研究的熱點[8-10].本研究中，筆者合成了一種新的羅丹明衍生物2，6-二羅丹明B酰肼西夫堿(2)，該化合物以羅丹明B為原料經(jīng)兩步反應(yīng)得到.在乙腈溶液中，當(dāng)用520 nm的光激發(fā)探針分子時，無熒光產(chǎn)生，而向其中加入Fe3+離子后，溶液變?yōu)榉奂t色，且在588 nm處有強的熒光，而其它金屬離子加入后無強的熒光，該探針能高選擇性的檢測三價鐵離子.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀(德國Bruker公司，400 MHz)；Biflex III質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；紫外光譜儀(日本島津公司，1601型)；熒光光譜儀(日本日立公司，F(xiàn)-4500).

化學(xué)試劑均為分析純國產(chǎn)試劑(除乙腈為色譜純外)，溶劑均經(jīng)常規(guī)純化處理過程處理.金屬離子Ni2+、Fe3+、Ag+、Pb2+、Ca2+、Cd2+溶液均用其水合硝酸鹽配制而成，Cu2+、Zn2+、Mn2+溶液均用其水合高氯酸鹽配制而成.

1.2 合成與表征

羅丹明酰肼(1)參照文獻方法合成[10]，產(chǎn)率77%.

制備羅丹明衍生物(2)：取1.5 g羅丹明酰肼、0.44 g間苯二甲醛置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL絕對無水甲醇溶解，回流反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，過濾，用適量甲醇洗滌所得固體，真空干燥，甲醇重結(jié)晶得純產(chǎn)物1.12 g，產(chǎn)率58%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ∶1.14 (t, J=6.92 Hz, 24H), 3.31 (q, J=6.92 Hz, 16H), 6.20 (d, J=8.56 Hz, 4H), 6.44-6.51 (m, 8H), 7.09 (d, J=8.56 Hz, 2H), 7.15-7.20 (m, 1H), 7.45-7.48 (m, 5H), 7.60 (d, J=6.88 Hz, 2H), 7.97 (d, J=6.88 Hz, 2H), 8.35 (s, 2H).13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ∶12.6, 44.2, 65.7, 98.0, 105.6, 107.9, 123.3, 123.6, 127.5, 128.0, 128.1, 128.4, 133.3, 135.3, 146.0, 148.9, 152.2, 152.8, 165.1. MALDI-TOF: calcd:1011.3, found:1011.6.

圖1 羅丹明衍生物2的合成路線圖

1.3 測量方法

準(zhǔn)確移取3 mL濃度為5×10-6mol/L2的標(biāo)準(zhǔn)液于熒光池中，測定其紫外-可見吸收光譜及熒光光譜.再加入相應(yīng)體積的10-2mol/L各種金屬離子的溶液，搖勻，靜置2 min，測定其熒光光譜.

熒光光譜測試過程參數(shù)：激發(fā)波長為520 nm， 狹縫寬度為5.0 nm/5.0 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜性質(zhì)研究

如圖2為羅丹明衍生物2(3 mL,5×10-6mol/L)及加入Fe3+(15 μL, 5×10-5mol/L)后的紫外-可見光吸收(圖2A)及熒光光譜圖(圖2B)，由圖可知，在乙腈溶液中化合物2是無色的，當(dāng)向其中加入Fe3+.后，溶液馬上變?yōu)榉奂t色，紫外-可見光譜對應(yīng)于560 nm處產(chǎn)生強的吸收峰.當(dāng)用520 nm光激發(fā)化合物2的乙腈溶液時，無熒光產(chǎn)生，而當(dāng)向其中加入Fe3+后，其產(chǎn)生強的熒光，且最大發(fā)射峰值位于588 nm處.由光譜的變化情況可知，當(dāng)向化合物2中加入Fe3+后，羅丹明螺環(huán)被打開，體系成開環(huán)狀態(tài)，溶液顏色及熒光都從無到有，模擬了一個離子控制溶液顏色及熒光的“關(guān)-開”過程.

圖2 化合物2及2+ Fe3+的紫外-可見吸收光譜(A)及熒光光譜(B)

2.2 選擇性研究

測試了在羅丹明衍生物2的乙腈溶液(5×10-6mol/L)中加入各種過渡金屬離子后的熒光光譜(激發(fā)波長為520 nm)，如圖3所示，未加金屬離子前，2的乙腈溶液無熒光，而在2中加入鐵離子后，2的熒光顯著增強(715倍)且紅移至588 nm.Zn2+(99倍)和Pb2+(50倍)也導(dǎo)致熒光增強，但是他們的增強僅為鐵離子的1/7和1/14，其它過渡金屬離子增強都在5倍以下.因此，羅丹明衍生物2是一個高選擇性的鐵離子熒光探針.

圖3 化合物2(5×10-6 mol/L)的乙腈溶液中加入的各種金屬離子(5×10-5 mol/L)后溶液的熒光光譜

其它過渡金屬離子對化合物2檢測Fe3+的干擾情況進行了研究.在2的乙腈中加入其它過渡金屬離子，再向其中加入Fe3+后其熒光增強效應(yīng)(FEF為加入Fe3+后和加入Fe3+前熒光強度比值)變化如圖4所示，加入Ag+、Cd2+、Hg2+、Zn2+后其熒光的增強效應(yīng)稍有增加，這可能是上述離子的加入導(dǎo)致羅丹明衍生物的平衡進一步向開環(huán)移動.而加入Co2+、Cu2+、 Mn2+、Ni2+、Pb2+后熒光增強倍數(shù)減少，特別是Co2+和Cu2+，原因可能為這兩種金屬是順磁性的金屬，都具有較強的熒光淬滅能力，對羅丹明衍生物2的熒光有一定的淬滅作用.總而言之，其它過渡金屬離子對鐵離子檢測的干擾很小.

圖4 向化合物2中加入各種過渡金屬離子后，再向其中加入Fe3+后的熒光增強效應(yīng)

2.3 絡(luò)合比例與絡(luò)合常數(shù)測定

利用Job’s Plot方法配制了一系列化合物2與鐵離子總濃度為1×10-5mol/L，濃度比分別為0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1和10∶0的溶液，分別測定其紫外-可見吸收光譜，在最大吸收波長561 nm處取值.如圖5所示,當(dāng)染料分子與鐵離子濃度比為1∶2時吸光度達到最大值，表明Fe3+與染料的結(jié)合比為2∶1.

圖5 在化合物2與鐵離子總濃度為10-5 mol/L的CH3CN中，隨鐵離子比例的變化溶液在561 nm處吸收值的變化圖

注：[2] + [Fe3+] =10-5mol/L.

在化合物2中逐步滴加Fe3+的熒光變化曲線如圖6所示，隨著鐵離子的加入，染料在588 nm處的發(fā)射光不斷增強，依據(jù)熒光滴定曲線數(shù)值，可以利用非線性擬合方法得到其絡(luò)合常數(shù)，擬合公式如下[11]:

圖6 滴加Fe3+至化合物2中時熒光光譜變化圖

圖7 Benesi-Hildebrand線性分析曲線

2.4 絡(luò)合機理探討

在化合物2與Fe3+的乙腈溶液中，加入EDTA(2×10-4mol/L)，溶液在588 nm處的熒光消失，羅丹明衍生物2又回到了關(guān)環(huán)狀態(tài).原因為EDTA具有強的過渡金屬離子配位能力，其與鐵離子的絡(luò)合常數(shù)遠大于羅丹明衍生物2與Fe3+，F(xiàn)e3+進而與EDTA絡(luò)合，羅丹明又回到了關(guān)環(huán)狀態(tài)，熒光消失，羅丹明衍生物2的開環(huán)-閉環(huán)是一個可逆的過程.筆者推測染料化合物2與Fe3+的可能的絡(luò)合方式如圖8所示，羅丹明環(huán)上的羰基及西夫堿中的氮原子與Fe3+進行配位，而鐵為六配位金屬離子，另外四個配位點可能是與溶劑乙腈分子配位，形成1∶2的絡(luò)合物.羅丹明染料位點與Fe3+絡(luò)合后，螺環(huán)碳打開，形成了氧雜蒽環(huán)結(jié)構(gòu)，這個共軛大鍵的形成使得其紫外-可見吸收及熒光大幅增強.

圖8 鐵離子與化合物2結(jié)合機理示意圖

3 結(jié) 語

設(shè)計合成了一種新型的羅丹明衍生物2，結(jié)果表明，在乙腈溶液中化合物2為一個高選擇性的Fe3+熒光探針；測試了向2的乙腈溶液中加入各種金屬離子后的熒光變化情況，結(jié)果表明，加入鐵離子后，化合物2在588 nm處的熒光相對值增加了715倍，其它過渡金屬離子除Zn2+(99倍)和Pb2+(50倍)導(dǎo)致一定的熒光增強外都無熒光增強.后續(xù)工作重點為繼續(xù)修飾其它特殊的官能團以增加化合物2類衍生物的水溶性，為其在環(huán)境檢測及生物應(yīng)用中打下基礎(chǔ).

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