李 亮

（遼寧省興城市婦女兒童醫(yī)院，遼寧興城 125100）

在對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的研究中發(fā)現(xiàn)，免疫功能異常會(huì)導(dǎo)致自然流產(chǎn)。作為在正常子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)和功能維持中起重要作用的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族，無(wú)論何種原因引起其表達(dá)異常，都將影響子宮內(nèi)膜，從而可能導(dǎo)致妊娠失敗。本研究通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中HSP70表達(dá)，并與人工流產(chǎn)術(shù)取出的正常絨毛進(jìn)行比較，來(lái)探討HSP70在早期自然流產(chǎn)中的作用，從而為本病發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2008年1月～2009年1月遼寧省興城市婦女兒童醫(yī)院婦科門診就診的孕12周以內(nèi)難免流產(chǎn)患者51例作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期孕12周以內(nèi)無(wú)先兆流產(chǎn)而要求終止妊娠者30例作為對(duì)照組，排除帶節(jié)育器妊娠，無(wú)肝腎疾病，近期無(wú)感染性病變、未行保胎及雌孕激素替代治療。

1.2 主要試劑

兔抗人HSP70多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑為進(jìn)口分裝，均購(gòu)于Maxim公司。

1.3 方法

將以負(fù)壓吸引取出的絨毛清水沖洗干凈后立即用10%甲醛液固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，4 pm連續(xù)切片、編號(hào)保存。免疫組化SP染色法，DAB顯色，按ABC免疫組化染色步驟為。①切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗5 min×2；②10 ml/L H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min，蒸餾水洗5 min×2；③微波修復(fù)抗原（pH 6.0檸檬酸緩沖液）10 min，蒸餾水洗5 min×2；④3 mol尿素消化 30 min， PBS(10 mmol/L，pH 7.4)振洗 5 min×2；⑤100 ml/L牛血清白蛋白（BSA）封閉15 min，室溫吸干；⑥滴加一抗 Bad，Bag1（稀釋度為 1∶50，1∶100，1∶200，1∶300，1∶400 和1∶500），4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫 30 min，PBS 振洗 5 min×2；⑦滴加生物素化橋抗 （1∶100），37℃，40 min，PBS 振洗 5 min×2，En-Vision法滴加 EnVision液 37℃ 40 min，PBS振洗 5 min×2；⑧滴加 ABC 復(fù)合物（1∶100），37℃，40 min，PBS 振洗 5 min×2；⑨DAB顯色，襯染，脫水透明，封固，觀察。所示見圖1。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

采取半定量評(píng)分方法進(jìn)行細(xì)胞染色計(jì)分，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占百分比計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜24%，記0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占25%～75%，記1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占76%以上，記2分。按染色深淺計(jì)分：淺黃色染色強(qiáng)度為弱，記0分；棕黃色為中等強(qiáng)度染色，記1分；棕褐色為強(qiáng)染色，記2分。以上兩分值相加。每標(biāo)本取3張切片，每切片取5個(gè)視野，計(jì)算平均值記為該標(biāo)本得分：＜2分記為陰性，≥2分記為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

自然流產(chǎn)患者絨毛中HSP70表達(dá)顯著增高，陽(yáng)性率達(dá)70.6%，與對(duì)照組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.63，P＜0.01），見表1。

表1 HSP70在各組絨毛中的表達(dá)情況（例）

3 討論

HSP是一組在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，其中又以HSP70分布最廣泛，是重要“分子伴侶”，具有協(xié)同免疫、抗凋亡、保護(hù)機(jī)體免受炎癥因子損害，在應(yīng)激過(guò)程中起重要作用。作為一種應(yīng)激蛋白，HSP在生理、病理和環(huán)境因素改變等情況下均可被誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在子宮內(nèi)膜、輸卵管及蛻膜組織中均有表達(dá)，且隨月經(jīng)周期改變而波動(dòng)，對(duì)維持子宮內(nèi)膜正常生理作用有著重要意義，而在子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉及內(nèi)膜異位癥等病理情況下呈高表達(dá)。最近在應(yīng)激學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，雌孕激素能夠?qū)?yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生抑制，妊娠期孕激素水平升高，使得子宮內(nèi)膜產(chǎn)生容受，妊娠得以維持，這可以解釋部分早期流產(chǎn)是由于孕酮缺乏所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中HSP70普遍升高，其分子學(xué)機(jī)制可能為HSP70的異常表達(dá)影響了激素和受體的結(jié)合，從而導(dǎo)致體內(nèi)甾體激素信號(hào)傳遞中斷，最終導(dǎo)致蛻膜不利于胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。此外，一些學(xué)者認(rèn)為HSP70廣泛存在于所有生物中，人與細(xì)菌有部分同源性，人體免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期暴露于微生物等環(huán)境中，反復(fù)感染后可能導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生。子宮作為腹膜外器官，由于性交等因素長(zhǎng)期暴露于機(jī)會(huì)感染的環(huán)境中，更增加了接觸過(guò)敏原的機(jī)會(huì)，使得孕前就有可能產(chǎn)生了針對(duì)HSP70的自身抗體，導(dǎo)致自然流產(chǎn)。綜上所述，筆者推測(cè)HSP可能通過(guò)以下幾種機(jī)制對(duì)生殖功能產(chǎn)生負(fù)面影響：HSP在蛻膜組織異常表達(dá)引起體內(nèi)激素紊亂、子宮敏感性增強(qiáng)；HSP蛋白分子具有抗原性，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而成為免疫系統(tǒng)的攻擊目標(biāo)；HSP在人與微生物間有相同的抗原序列，結(jié)果導(dǎo)致自身免疫等原因而引發(fā)流產(chǎn)。

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