董林青，邱向東，黃登峰，許廣振

（山東勝利股份有限公司生物工程部，山東濟(jì)南 250101）

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法又稱鱟試劑法,是一種利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝聚反應(yīng)來檢查藥品中內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定的方法。阿昔洛韋葡萄糖注射液是抗菌藥與抗病毒藥的化學(xué)藥品，本文參照文獻(xiàn)[1-3]報道的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，探討了阿昔洛韋葡萄糖注射液的內(nèi)毒素檢查的具體方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

鱟試劑（批號：20060427,λ 為 0.125 EU/ml，規(guī)格：0.10 ml/支，湛江安度斯生物有限公司；批號：200606040，λ為0.25 EU/ml，規(guī)格0.10 ml/支，福州新北生化工業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號：2006-4，160 EU/支,中國藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號：20070518，規(guī)格：5 ml/支,湛江海洋生物制品廠）；阿昔洛韋葡萄糖注射液3批樣品（批號：070901、070902、070903,國內(nèi)某醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：100 ml：阿昔洛韋0.1 g，葡萄糖5 g）。

1.2 試藥

XW-80型旋渦混勻器 （上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；S648型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療廠）；吸管；凝集管（75 mm）；試管、吸耳球、封口膜、試管架；超凈工作臺[4]，試驗所用玻璃器皿均經(jīng)重鉻酸鉀洗液處理后再以250℃烘烤1 h，以去除外源性細(xì)菌內(nèi)毒素[5]。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的建立

按細(xì)菌內(nèi)毒素公式L=K/M（K為人用每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，K=5 EU/（kg·h），M 為每千克體重每小時最大供試品劑量），根據(jù)本品制劑用法與用量中規(guī)定,該藥一次劑量為5 mg/kg，成人體重以60 kg計，即成人每日每次最大劑量為 300 mg，則 M=300 ml/60（kg·h），L=5.0/300/60=1.0 EU/ml，但考慮到藥品使用安全性要求及一般大容量輸液細(xì)菌內(nèi)毒素限值要求，將本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.5 EU/ml為宜。

2.2 鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核

按《中國藥典》2005年版規(guī)定進(jìn)行靈敏度復(fù)核，結(jié)果20060427 批靈敏度 λc＝0.171 EU/ml（λb＝0.125 EU/ml）；200606040 批靈敏度 λc＝0.25 EU/ml（λb＝0.25 EU/ml），均符合藥典規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

2.3 供試品干擾預(yù)試驗[6]

根據(jù)供試品內(nèi)毒素限值（L）為0.5 EU/ml,市售鱟試劑λ最低為0.03 EU/ml，計算出鱟試劑λ為0.25、0.06 EU/ml時的供試品稀釋倍數(shù)MVD=L/λ,即8.33～16.67倍，則最小有效濃度為0.12~0.06 mg/ml。取3批供試品,用BET水將供試品分別稀釋為 1.00、0.50、0.25 mg/ml，同時選擇 λ=0.25 EU/ml的鱟試劑,將每個濃度供試品液均制備含有2.000 λ（0.5 EU/ml）及0.125 λ（0.06 EU/ml）的細(xì)菌內(nèi)毒素作為供試品陽性液。每一濃度制備2支試管,同時設(shè)陰性對照、陽性對照，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，供試品預(yù)試驗為稀釋后對以上兩個廠家的鱟試劑均未產(chǎn)生干擾作用。

表1 干擾預(yù)試驗

2.4 供試品干擾試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，用供試品原液及BET水分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成表2所示的一系列濃度，每一濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液平行制備4支;另取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和此濃度的稀釋液各制備2支陰性對照管。按下式計算用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Es,以及此濃度的稀釋液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Et∶Es=lg-1(∑Xs/4)；Et=lg-1(∑Xt/4)。式中 Xs、Xt分別為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和稀釋液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。當(dāng) Es 在 0.5 λ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)時，且當(dāng) Es/Et在0.5～2.0（包括0.5和2.0）時,則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾試驗,結(jié)果見表2、3。干擾試驗結(jié)果表明，阿昔洛韋葡萄糖注射液（1 mg/ml）對鱟試劑不干擾,可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查。

表2 鱟試劑批號為20060427的干擾試驗結(jié)果

表3 鱟試劑批號為200606040的干擾試驗結(jié)果

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

將3批供試品按文獻(xiàn)[1]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查,分別用兩個廠家鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,結(jié)果見表4、5。結(jié)果表明，3批供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值均＜0.5 EU/ml，均符合規(guī)定。

表4 阿昔洛韋葡萄糖注射液（樣品1）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

表5 阿昔洛韋葡萄糖注射液（樣品2）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 結(jié)論

3批產(chǎn)品干擾試驗結(jié)果表明，阿昔洛韋葡萄糖注射液在稀釋濃度下沒有干擾，可以進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,依據(jù)《中國藥典》2005年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定原則,阿昔洛韋葡萄糖注射液采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔熱原檢查法是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄85.

[2]黃清泉,夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實驗設(shè)計[J].中國藥學(xué)雜志,1997,32(2):210.

[3]李海英,王瓊芬.乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥業(yè),2008,17(12):55-56.

[4]樊麗,趙金英.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查經(jīng)驗總結(jié)[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,5(5)13:82.

[5]張琦,徐梅,王曉利.細(xì)菌內(nèi)毒素法檢查5%果糖注射液[J].中外醫(yī)療,2008,23:133.

[6]國明,祝清芬,鄭力真.無菌、微生物限度及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗證中常見問題及分析[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2008,9(1):49.