紀 瑛

（甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730020）

苦參（Sophora flavescensAit）為豆科槐屬植物，是我國傳統(tǒng)藥用植物［1］。分布于河北，河南，陜西，甘肅，遼寧一帶的淺山區(qū)與坡地?？鄥⒂星鍩崂麧瘢铒L殺蟲之功效，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于治療急性細菌性痢疾，頑固性濕疹等疾?。?］，近年又用于治療非典和腫瘤［3］，尤其是天然綠色動植物殺蟲劑的開發(fā)使用［4，5］，使其用途越來越廣，隨著其用途的不斷研究與開發(fā)，其用量呈逐年遞增之勢。長期以來一直是以采挖野生資源提供藥源。由于過度采挖，使野生資源日漸耗竭，難以維持快速發(fā)展工業(yè)生產(chǎn)的藥源?，F(xiàn)行藥典以氧化苦參堿和苦參堿含量及其他常規(guī)鑒別項目作為控制苦參質(zhì)量的手段和指標［6］，但單一成分并不能全面地反映藥材質(zhì)量。近年來，已有苦參指紋圖譜的研究報道［7］，這些研究主要對野生苦參的指紋圖譜建立的方法與評價做了研究。對于栽培苦參的化學(xué)成分指紋圖譜以及與野生苦參的對比研究還未見報道，本文采用HLPC方法，對不同產(chǎn)地野生、人工栽培的苦參藥材進行分析，建立化學(xué)成分指紋圖譜，對苦參樣品的指紋圖譜進行評價比較，比較不同產(chǎn)地的苦參和人工栽培的苦參化學(xué)指紋圖譜，為苦參的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器與試劑

Ultimate 3000戴安高效液相色譜儀（美國戴安公司），二極管陣列檢測器（DAD），色譜柱C18（150 mm×6.4 mm），手動進樣器，電子分析天平，Anke TDL-40B離心機，隔膜真空泵及溶劑過濾器。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為重蒸餾水?？鄥φ账幉模?21019-200304），氧化苦參堿標準品（110780-200405）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 樣品及預(yù)處理

收集河北承德、河南盧氏、甘肅成縣的3份苦參野生藥材，甘肅岷縣的5份苦參栽培品材料，甘肅酒泉的5份苦參栽培品材，甘肅榆中的6份苦參栽培品材料。實驗用苦參野生藥材和栽培藥材經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物系藺海明研究員鑒定均為豆科槐屬植物苦參（Sophora flavescensAit）的根。所有樣品見表1。將各干燥的苦參樣品粉碎，置于干燥器中保存，備用。

表1 20批苦參藥材樣品來源

2 數(shù)據(jù)處理

SPSS（13.0）統(tǒng)計分析軟件;國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004版）軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化確定

苦參藥材主要有效成分為苦參類生物堿，綜合考慮所要檢測的苦參生物堿類化合物的極性，同時為確保所有成分能在一個色譜條件下均被洗脫，流動相A選用乙腈，流動相B選用水的二元體系對苦參樣品進行梯度洗脫，梯度程序以100%乙腈結(jié)束［8］。本實驗優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表2，流速0.5 mL/min。二極管陣列檢測器（DAD），比較200 nm，

220 nm，235 nm，245 nm和255 nm 5個檢測波長下的色譜峰，選擇波長235 nm為檢測波長。

表2 苦參藥材梯度洗脫程序

在上述優(yōu)化色譜條件下，色譜峰的分離度好，色譜峰在0～60 min內(nèi)分布，氧化苦參堿對照品和苦參對照藥材色譜圖見圖1和圖2。圖2與圖1比較可知，在相同色譜條件下，氧化苦參堿的保留時間與苦參對照藥材色譜圖中的3號峰一致。因此，推測對照藥材色譜圖中的3號峰為氧化苦參堿。

圖1 氧化苦參堿對照品HPLC色譜圖

圖2 對照藥材HPLC指紋色譜圖

3.2 提取條件的優(yōu)化選擇

以苦參藥材為樣品，選擇不同提取方法，不同溶劑進行比較試驗。回流提取用50%甲醇和85%乙醇作溶劑，回流時間1 h，超聲提取用50%甲醇、85%乙醇、氯仿作溶劑，用以上5種方法制備的供試品溶液，分別在上述優(yōu)化色譜條件下進樣，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖綜合評價提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%甲醇回流1 h的色譜圖出峰多，因此采用50%甲醇回流1 h提取方法為本實驗的最佳提取方法。

3.3 精密度

取一份苦參樣品（5號樣）的供試溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣5次，記錄指紋圖譜，計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.3% ～2.08%，峰面積比值的RSD為1.05%～3.69%，符合指紋圖譜的檢測要求。

3.4 穩(wěn)定性

取一份苦參樣品（5號樣）的供試溶液，在上述色譜條件下，分別在0，2，4，8，24 h 進樣測定，記錄指紋圖譜，計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.3% ～2.87%，峰面積比值的RSD為1.15% ～4.66%，表明供試液在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性

取苦參樣品（5號樣）5份，分別精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備供試液，在上述色譜條件下，分別進樣記錄指紋圖譜。計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.09% ～3.32%，峰面積比值的RSD為0.44% ～4.58%，符合指紋圖譜的檢測要求。

3.6 指紋圖譜建立與分析

按上述液相色譜條件測定了氧化苦參堿對照品、1個苦參對照藥材、19個不同產(chǎn)地野生和人工栽培的苦參樣品。采用相對保留時間確認指紋峰。色譜圖中以氧化苦參堿作為參比峰，相對保留時間即各指紋峰保留時間與同一圖譜中氧化苦參堿峰保留時間的比值。指紋峰峰相對峰面積即各指紋峰面積與同一圖譜中氧化苦參堿峰面積的比值。結(jié)果顯示，人工栽培苦參圖譜峰的數(shù)量普遍較對照藥材和野生藥材圖譜少，有些峰缺失。根據(jù)各樣品圖譜中色譜峰的相對保留時間，以氧化苦參堿對照品和對照藥材指紋圖譜作為參照譜，選擇了其中15個色譜峰作為指紋圖譜的特征峰（圖2，3，4），3號峰為氧化苦參堿，各共有峰相對保留時間RSD小于5%（表3）。計算共有峰的相對峰面積，建立苦參的指紋圖譜（表4）。對15個共有峰相對保留時間進行聚類分析，結(jié)果見圖5，15個共有峰可分為5個峰群，1號峰和2號峰歸為第1 個峰群，3，4，5，6，7 號峰歸為第 2 個峰群，8，9，10 號峰歸為第3個峰群，11號峰為第4個峰群，12，13，14，15號峰歸為第5個峰群。

圖3 野生藥材HPLC指紋色譜圖

圖4 栽培藥材HPLC指紋色譜圖

表3 20批樣品共有峰相對保留時間

表4 20批樣品共有峰峰面積比值

3.7 指紋圖譜相似度評價

對1個苦參對照藥材、19個不同產(chǎn)地野生和人工栽培的苦參樣品的HPLC指紋圖譜共有峰進行相似度計算，以相關(guān)系數(shù)表征相似度，結(jié)果見表5，從中可以看出，19個苦參樣品指紋圖譜共有峰與對照藥材（1號樣）相似度為0.96～0.99，其中甘肅成縣產(chǎn)野生苦參（7號樣）和河北承德產(chǎn)野生苦參（8號樣）與對照藥材的相似度最高，而栽培苦參與對照藥材的相似度相對較低。19個苦參樣品之間相似度為0.93～0.99，岷縣栽培1年生苦參（2號樣）與其他各樣品之間相似度最低，可能是栽培年限低的原因。結(jié)果表明，栽培苦參和野生苦參存在差異，但是20個樣品指紋圖譜的相似度大于0.93，說明建立的苦參樣品指紋圖譜相似度較高，具有一定的代表性。

表5 20批樣品指紋圖譜相似度分析

圖5 苦參20個樣品共有峰聚類分析結(jié)果

4 討論與結(jié)論

本實驗通過比較不同的樣品制備方法，考察不同的色譜條件，檢測波長，建立了人工栽培苦參和野生苦參藥材HPLC化學(xué)成分指紋圖譜的檢測方法（未知譜峰，有待進一步標定），為苦參藥材的全面質(zhì)量控制研究提供參考。

HPLC指紋圖譜分析與相似度評價結(jié)果表明苦參人工栽培藥材、野生藥材與對照藥材化學(xué)指紋圖譜存在15個共有峰，分成5個峰群。經(jīng)相似度計算，19個苦參樣品之間相似度為0.93～0.99。但是人工栽培藥材與野生藥材之間存在一定差異明顯，表現(xiàn)栽培年限越低相似度越小，推測造成兩者存在明顯差異的主要原因是人工栽培藥材的生長年限較野生的低，而且受栽培措施的影響，可能使其化學(xué)成分或許發(fā)生一些變化。

根據(jù)以上結(jié)果，建議苦參在人工栽培過程中注意栽培措施和載培年限對化學(xué)成分的影響。

［1］樓之岑，秦 波.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，1995:343-376.

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［5］張淑紅，周寶利，張 磊，等.土壤添加蛇床子（Cnidium monnieri）和苦參（Sophora flavescens）對茄子黃萎病及根際微生物的化感影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2008，28（10）:5194-5199.

［6］中國藥典［S］.一部.2005:141.

［7］徐今寧，蔣貴昱，湯建華.苦參藥材高效液相指紋圖譜分析方法研究［J］.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)版，2008，25（2）:15-18.

［8］周玉新.中藥指紋圖譜研究技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.