劉姍姍，李靜平，高音

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon-regulated factor-3，IRF-3）作為一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）介導(dǎo)的髓樣分化因子 88（myeloid differentiationfactor 88，MyD88）非 依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF信號途徑）抵抗病原體入侵的免疫應(yīng)答的啟動過程中起著重要作用，IRF-3活化后形成同源二聚體轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)β干擾素（interferon β，IFN-β）基因表達(dá)［1，2］。目前，對 TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴信號通路中IRF-3的研究主要集中在抗感染免疫反應(yīng)中［3，4］，本研究采用 TLR4 抗體封閉阻斷 TLR4，Western blot檢測皮質(zhì)TLR4、IRF-3和IFN-β蛋白表達(dá)量，旨在觀察腦缺血再灌注損傷是否激活TLR4及采用TLR4抗體阻斷TLR4后，IRF-3和IFN-β的表達(dá)變化，探討TLR4參與腦缺血再灌注的反應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗TLR4單克隆抗體（sc-16240）、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔、羊抗羊IgG二抗、β-actin抗體、兔抗IRF-3單克隆抗體（sc-9082）、山羊抗IFN-β單克隆抗體 IgG（sc-17569）（美國 Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物的分組

健康昆明種小鼠144只，雌雄兼用，體質(zhì)量18~22 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，隨機(jī)分為3 組：（1）假手術(shù)組（S 組，n=48）；（2）缺血再灌注組（I組，n=48）；（3）TLR4 阻斷組（T 組，n=48）。各組又分 1 d、2 d、3 d、4 d 4 個時間點(diǎn)組（n=6）。

1.3 小鼠腦缺血再灌注模型的制備

手術(shù)在室溫25℃、濕度50%的條件下進(jìn)行。用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg），絡(luò)合碘消毒，行頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈（common carotid arteries，CCA），用動脈夾夾閉小鼠雙側(cè)頸總動脈血流，阻斷12 min后，松開動脈夾實(shí)現(xiàn)再灌注。在阻斷雙側(cè)頸總動脈血流后，出現(xiàn)心跳加快、呼吸幅度加深、頻率先加快、后減慢典型生理變化過程的小鼠，作為缺血成功樣本入選。TLR4阻斷組小鼠缺血10 min時在右側(cè)頸總動脈內(nèi)注入TLR4抗體（10 μg/ml）0.1 ml，注射為緩慢注射，用微量注射泵在2 min內(nèi)注射完畢，縫合切口。缺血再灌注組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈，其余步驟同上。術(shù)中用白熾燈保持小鼠肛溫在（37±0.5）℃。術(shù)后置清潔飼養(yǎng)籠中觀察。

1.4 Western blot檢測 TLR4、IRF-3 和IFN-β 表達(dá)

各組動物分別于再灌注1 d、2 d、3 d、4 d時間點(diǎn)（n=6）立即冰上斷頭取右側(cè)皮質(zhì)，加入適量的細(xì)胞裂解液 150 μl［0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl（pH7.6），0.001 mol/L EDTA （pH8.0），1 μg/ml aprotinin，100 μg/ml PMSF］，超聲粉碎，離心。 用 Lowry法測定蛋白濃度。取總蛋白30μg經(jīng)120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)印，雜交，暗室內(nèi)ECL反應(yīng)，X線顯影、定影。掃描蛋白印跡條帶。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

蛋白條帶用自動凝膠成像系統(tǒng)Chemi Imager 5500 V2.03軟件進(jìn)行掃描，用Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行分析測得平均光學(xué)密度值（integrated density value，IDV）。所得數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計分析，樣本均數(shù)間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot分析顯示缺血再灌注組TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于TLR4阻斷組和假手術(shù)組（圖1）。缺血再灌注組TLR4表達(dá)在1 d、2 d、3 d和4 d分別高于TLR4阻斷組（P<0.05）。見表1。

表1 TLR4在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.1 The IDV of TLR4 expression at different reperfusion time point（±s）

表1 TLR4在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.1 The IDV of TLR4 expression at different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or T group.IDV，integrated density value；I，ischemia reperfusion group；T，TLR4 blocking group；S，shamgroup

Group n Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.083±0.0321） 0.214±0.0211） 0.493±0.0341） 0.428±0.0051）T 6 0.069±0.016 0.133±0.009 0.197±0.016 0.186±0.015 S 6 0.057±0.008 0.126±0.006 0.138±0.003 0.152±0.007

2.2 IRF-3蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot分析顯示缺血再灌注組IRF-3蛋白表達(dá)水平明顯高于TLR4阻斷組和假手術(shù)組（圖2）。缺血再灌注組IRF-3表達(dá)在1 d、2 d、3 d和4 d分別高于TLR4阻斷組（P<0.05）。見表2。

2.3 IFN-β蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot分析顯示缺血再灌注組IFN-β蛋白表達(dá)水平明顯高于TLR4阻斷組和假手術(shù)組（圖3）。缺血再灌注組IFN-β蛋白在再灌注1 d開始表達(dá)，3 d達(dá)到高峰，4 d開始下降（圖3）。缺血再灌注組IFN-β表達(dá)在1 d、2 d、3 d和4 d高于TLR4阻斷組（P<0.05）。見表3。

3 討論

表2 IRF-3在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.2 The IDV of IRF-3 at different reperfusion time point（±s）

表2 IRF-3在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.2 The IDV of IRF-3 at different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or Tgroup.

Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.085±0.0041） 0.272±0.0051） 0.523±0.0211） 0.159±0.0031）T 6 0.057±0.003 0.184±0.001 0.278±0.006 0.166±0.017 S 6 0.066±0.004 0.126±0.004 0.133±0.008 0.189±0.001 Group n

表3 IFN-β在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.3 The IDV of IFN-β in each group with different reperfusion time point（±s）

表3 IFN-β在小鼠右側(cè)皮質(zhì)表達(dá)的ID值（±s）Tab.3 The IDV of IFN-β in each group with different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or Tgroup.

Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.191±0.0021） 0.207±0.0041） 0.727±0.0151） 0.506±0.0191）T 6 0.187±0.002 0.202±0.006 0.434±0.003 0.284±0.007 S 6 0.177±0.002 0.177±0.002 0.235±0.007 0.293±0.006 Group n

TLR4是一種跨膜蛋白受體，TLR4被激活后，其信號經(jīng)由2條信號通路由胞外向胞內(nèi)傳導(dǎo)：MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑，MyD88非依賴性途徑又稱TRIF依賴性，TRIF可激活TBK1 ［TRAFfamily-member-associated NF-κB activator（TANK）binding kinase 1］，TBK1由一個可誘導(dǎo)的 I-κBkinase（IKK-i）家族組成［5］。TBK1/IKK-i直接使IRF-3和干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon response factor 7，IRF-7）磷酸化［6］，磷酸化的 IRF-3 和IRF-7形成同源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，導(dǎo)致IFN-β和一系列IFN誘導(dǎo)的基因表達(dá)［7］。目前，TLR4介導(dǎo)的TRIF信號通路的研究主要集中在對抗微生物感染的免疫反應(yīng)中［8，9］，在腦缺血再灌注損傷中該通路是否介入尚未見報道。

由于IRF-3是TLR4信號傳導(dǎo)通路的一個關(guān)鍵分子，本研究在腦缺血再灌注損傷激活TLR4后，觀察了IRF-3及其誘導(dǎo)的IFN-β在小鼠皮質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示：缺血再灌注組IRF-3蛋白表達(dá)水平明顯高于TLR4阻斷組和假手術(shù)組（P<0.05），說明TLR4被激活后，引起IRF-3表達(dá)量增加，而采用TLR4抗體阻斷后，IRF-3表達(dá)量減少。提示IRF-3參與了腦缺血再灌注TLR4激活后的信號傳導(dǎo)路徑。Western blot結(jié)果顯示：缺血再灌注組小鼠的皮質(zhì)在TLR4被激活并引起IRF-3的過表達(dá)后，IFN-β表達(dá)量顯著高于TLR4阻斷組和假手術(shù)組（P<0.05）；而采用TLR4抗體封閉TLR4阻斷后，TLR4阻斷組的IFN-β表達(dá)量明顯低于缺血再灌注組（P<0.05），提示在腦缺血再灌注的病理發(fā)展過程中，TLR4-IRF-3-IFN-β信號通路可能被激活；阻斷TLR4后，IRF-3和IFN-β表達(dá)量明顯減少。目前，直接針對TLR4-IRF-3-IFN-β信號通路的研究較少，這一途徑在腦缺血再灌注中所發(fā)揮的作用還有待于進(jìn)一步深入研究。

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