原 皓，李時(shí)光，崔慎茹

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濰坊261031)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎癥，目前其確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚且無(wú)特異性根治措施。甘草酸二銨(DG)是甘草活性成分甘草次酸的左旋構(gòu)型，具有與皮質(zhì)類固醇類似的非特異性抗炎作用［1，2］。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是趨化因子CC類亞家族成員之一，可促進(jìn)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)分泌。2009年7月，我們觀察了DG對(duì)UC大鼠結(jié)腸炎癥及結(jié)腸組織MCP-1表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討其抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量(230±10)g，4～5周齡，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，DG (商品名甘利欣，水針劑，批號(hào)H10940190)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將30只雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為觀察組、模型組和對(duì)照組各10只，均禁食、不禁水 24 h，10%水合氯醛 4.5 ml/kg腹腔注射麻醉，觀察組、模型組參照文獻(xiàn)方法［3］制作UC模型:大鼠取頭低尾高體位，將聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)肛門緩慢插入結(jié)腸8 cm并經(jīng)其注入TNBS(與無(wú)水乙醇以1∶1混勻)50～60 mg/kg，倒提大鼠30 s后使其平躺，自然清醒、常規(guī)飼養(yǎng)。其后觀察組和模型組于造模第1～10天分別腹腔注射DG 40 mg/(kg·d)及生理鹽水2 ml;對(duì)照組操作同模型組，但以生理鹽水代替TNBS。造模第10天時(shí)處死動(dòng)物，取距肛門約8 cm處結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剪開，冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干稱重，將結(jié)腸沿長(zhǎng)徑切成相等兩份，一份以4%多聚甲醛固定，每段結(jié)腸自距肛門1、3 cm處取2塊組織標(biāo)本，另于炎癥嚴(yán)重或潰瘍處取1塊組織標(biāo)本，石蠟包埋、切片(厚4 μm)，HE染色觀察組織學(xué)改變;另一部分稱重后置-80℃冰箱備用。

1.3 結(jié)腸炎癥評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)期間每日記錄各組糞便性狀、體質(zhì)量及腸鏡表現(xiàn)。采用疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分及組織學(xué)損傷評(píng)分評(píng)價(jià)結(jié)腸炎癥:①DAI評(píng)分:造模后10 d綜合大鼠體質(zhì)量下降百分率(不變計(jì)0分，1% ～5%計(jì)1分，6% ～10%計(jì)2分，11%～15%計(jì)3分，＞15%計(jì)4分)、大便黏稠度(正常計(jì)0分，松散計(jì)2分，腹瀉計(jì)4分)和大便出血(無(wú)計(jì)0分，隱血陽(yáng)性計(jì)2分，顯性出血計(jì)4分)進(jìn)行計(jì)分［4］。②組織學(xué)損傷評(píng)分:取10個(gè)視野(100×)的平均評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):正常結(jié)腸黏膜計(jì)0分，隱窩缺損1/3計(jì)1分，隱窩缺損2/3計(jì)2分，固有層覆蓋單層上皮伴輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)3分，黏膜糜爛、潰瘍伴顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)4分。

1.4 結(jié)腸組織MCP-1表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取各組1.2備用結(jié)腸組織提取總RNA，測(cè)定RNA純度和含量，進(jìn)行cDNA合成及DNA擴(kuò)增;取5 μl PCR產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中80 V電壓電泳25 min，將凝膠置于紫外光可見分析裝置中用UVP公司(美國(guó))圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描拍照，檢測(cè)各電泳條帶A值、計(jì)算MCP-1相對(duì)表達(dá)量MCP-1/GAPDH。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，先行One-way ANOVA檢驗(yàn)，再以SNK-q檢驗(yàn)行組間比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組和模型組TNBS灌腸后1～2 d即出現(xiàn)與人類急性期結(jié)腸炎相似的鏡下組織學(xué)表現(xiàn)，其中模型組3例實(shí)驗(yàn)期間死亡。三組DAI、組織學(xué)損傷評(píng)分及MCP-1相對(duì)表達(dá)情況見表1。

表1 三組DAI、組織學(xué)損傷評(píng)分及MCP-1相對(duì)表達(dá)比較(±s)

表1 三組DAI、組織學(xué)損傷評(píng)分及MCP-1相對(duì)表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

MCP-1/GAPDH組別 n DAI評(píng)分(分)組織學(xué)損傷評(píng)分(分)觀察組10 0.4±0.2 1.0±0.3 1.05±0.16模型組 7 7.2±0.8* 6.2±1.0* 4.98±0.37*對(duì)照組 10 3.6±0.5＊△ 3.6±0.7＊△ 3.10±0.24＊△

3 討論

UC以腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn)［5］，病程遷延不愈，亦有發(fā)生癌變的可能［6］。流行病學(xué)資料提示，UC發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均有逐年增加的趨勢(shì)［7，8］。研究顯示，參與UC發(fā)病機(jī)制的因素有免疫、遺傳、環(huán)境、自由基損傷等，其中某些趨化因子起重要作用。趨化因子是一類具有趨化作用的小分子蛋白質(zhì)或多肽，可作為調(diào)節(jié)因子參與機(jī)體重要的生理學(xué)和病理生理學(xué)過(guò)程及免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中MCP-1因與多種疾病有關(guān)而備受關(guān)注，其最早自鼠成纖維細(xì)胞中分離出來(lái)，目前已知單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞可在受刺激時(shí)誘導(dǎo)性分泌MCP-1，這種刺激可由IL-1、IFN-γ、PDGF等細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子引起。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí) MCP-1可通過(guò)與其受體CCR2的作用募集單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞至炎癥發(fā)作部位;能夠觸發(fā)循環(huán)中的細(xì)胞擴(kuò)展變形，牢固黏附于釋放選擇素的血管內(nèi)膜細(xì)胞表面并可介導(dǎo)細(xì)胞穿透血管內(nèi)膜浸潤(rùn)至炎癥局部;還可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，造成超氧陰離子產(chǎn)生和釋放，上調(diào)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附分子。

DG是中藥甘草有效成分的第三代提取物，除具有非特異性抗炎作用外，尚有鎮(zhèn)痛、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)、抗脂質(zhì)氧化、改善肝功能及調(diào)節(jié)免疫等生物活性等作用［1，2］，特點(diǎn)是療效好、無(wú)激素樣不良反應(yīng)，目前主要用于治療肝炎等疾病。國(guó)內(nèi)外有關(guān)其治療UC的報(bào)道很少，且機(jī)制不明。本研究顯示，觀察組和模型組DAI、組織學(xué)損傷評(píng)分及MCP-1相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，尤其以模型組為著。提示MCP-1表達(dá)隨組織內(nèi)炎癥細(xì)胞功能活躍程度升高而增加，是反映潰瘍性結(jié)腸炎病變程度的較好指標(biāo);DG可減輕UC大鼠結(jié)腸炎癥程度。

總之，DG能減輕UC大鼠結(jié)腸炎癥程度，可能機(jī)制為下調(diào)MCP-1表達(dá)。

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