付文琴，鄧愛軍，杜 瑋，臧 萍

(1新疆維吾爾自治區(qū)哈密紅星醫(yī)院，新疆哈密839000;2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物與人體內(nèi)的一類轉(zhuǎn)錄因子，通過對(duì)缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，在維持機(jī)體對(duì)缺氧的適應(yīng)能力中發(fā)揮重要作用。近來在部分缺血性視網(wǎng)膜疾病組織中發(fā)現(xiàn)HIF-1表達(dá)增加，與視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)及新生血管形成密切相關(guān)［1］。因此，HIF-1成為抗視網(wǎng)膜血管新生的重要靶點(diǎn)。2008～2009年，我們觀察了HIF-1α反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的牛眼視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)后HIF-1α及VEGF的表達(dá)，探討HIF-1α ASODN治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 HIF-1αASODN序列根據(jù)GenBank HIF-1α基因 cDNA而設(shè)計(jì)。antisense為:5'-GCCGGCGCCCTCCAT3'。上海生工公司合成，并將各個(gè)磷酸鍵硫化修飾，其中5個(gè)OD260的HIF-1α ASODN 5'端標(biāo)記熒光素(FAM);F12培養(yǎng)基(Gibco);EBM-2 Basal Meidum(北京畢特博);胎牛血清;Lipofectin脂質(zhì)體(Invitrogen);兔抗HIF-1α多克隆抗體(武漢博士德)。二步法免疫組化試劑盒(北京中山公司)。其他試劑皆為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 健康牛眼(死后3 h內(nèi)取出)去除球外結(jié)締組織，用700 ml/L乙醇浸泡1 min，PBS液沖洗后沿角膜緣后4 mm剪開眼球壁，完整剝出視網(wǎng)膜神經(jīng)層，剪碎、勻漿，金屬篩網(wǎng)過濾(孔徑80 μm)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)沖洗，洗脫液1 000 r/min離心7 min，37 ℃、0.2 g/L膠原酶I消化1～2 h，小牛血清終止消化，用PBS液離心洗滌，收集細(xì)胞，用含2 00 ml/L胎牛血清的M199和EBM-2混合培養(yǎng)液混勻，接種于包被有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入50 ml/L CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。次日將未貼壁細(xì)胞移入另一培養(yǎng)皿內(nèi)，原培養(yǎng)皿內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次。細(xì)胞長至近融合狀態(tài)時(shí)，用1 g/L胰蛋白酶消化、傳代。采用第Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)法鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞純度為90%以上。無菌Eppendorf小管中，用無抗生素?zé)o血清的F12培養(yǎng)基，按每孔 HIF-1α ASODN 3 μg，Lipofectin 和HIF-1α ASODN為1∶5(g/L)將所需的 Lipofectin和HIF-1α ASODN 分別稀釋至 100 μl，室溫放置 10 min。將上述兩管中液體混合，并用加樣器輕輕打勻，室溫放置45 min，使之形成寡核苷酸脂質(zhì)體混合體。然后加入0.8 ml無抗生素?zé)o血清的F12培養(yǎng)基，使之總轉(zhuǎn)染體積達(dá)到1 ml。將培養(yǎng)細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及缺氧處理 兩組細(xì)胞分別接種6孔培養(yǎng)板(1×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)過夜。用4℃無抗生素?zé)o血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，吸盡殘存的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染組將寡核苷酸脂質(zhì)體混合體逐滴加入培養(yǎng)板中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后吸去含有寡核苷酸脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞3次，除去細(xì)胞外未能進(jìn)入細(xì)胞的HIF-1α ASODN;將6孔板置于熒光顯微鏡下觀察攝片。轉(zhuǎn)染6 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光斑。說明HIF-1α ASODN能被脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)BREC細(xì)胞。未轉(zhuǎn)染組不行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度125 μmol/L的CoCl2，于缺氧 0、1、2、4、8、16 h 時(shí)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各測(cè)4個(gè)培養(yǎng)孔。

1.4 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) ①HIF-1α表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法。培養(yǎng)皿底放入蓋玻片并固定，將培養(yǎng)細(xì)胞接種其中，待細(xì)胞到達(dá)合適密度后，-10℃甲醇固定5 min，沖洗后，3 g/L吐溫30 min，PBS洗3次，每次2 min，1∶100稀釋的 Rabbit Anti-HIF-1α 于 4℃過夜，PBS洗3次，每次2 min，滴加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，37℃孵育60 min，PBS洗3次，每次2 min。PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):熒光顯微鏡下(400×)HIF-1α蛋白以細(xì)胞核或胞質(zhì)呈綠色熒光為陽性，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光分析。②VEGF檢測(cè):采用ELISA法。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在492 nm處比色定量。對(duì)VEGF水平在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高值以外的標(biāo)本稀釋10～100倍后重新測(cè)定。所有標(biāo)本均作雙管檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α表達(dá) 未轉(zhuǎn)染組缺氧開始時(shí)HIF-1α有極低表達(dá)，在缺氧1 h時(shí)表達(dá)量顯著上升，4 h達(dá)到高峰，16 h后下降。而轉(zhuǎn)染組HIF-1α的表達(dá)始終在極低水平，兩組間有顯著性差異(P＜0.01)。見圖1。

圖1 兩組HIF-1α免疫熒光分析結(jié)果

2.2 VEGF水平 見表1。

表1 兩組缺氧各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清液中VEGF 水平(ng/L，±s)

表1 兩組缺氧各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清液中VEGF 水平(ng/L，±s)

檢測(cè)時(shí)間(h) 未轉(zhuǎn)染組 轉(zhuǎn)染組 P值0 65.25± 4.15 64.73±3.58 ＞0.05 1 75.32± 3.63 65.55±4.18 ＜0.05 2 98.23± 5.54 69.53±4.94 ＜0.05 4 169.55± 8.15 78.83±4.77 ＜0.01 8 258.92±15.32 92.79±6.49 ＜0.01 16 206.53±12.44 104.66±7.62 ＜0.01

3 討論

視網(wǎng)膜缺血時(shí)釋放的新生血管生長因子或血管源性生長因子是導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞異常增殖和新生血管形成的主要原因。目前研究表明，VEGF可能是最直接的眼球內(nèi)新生血管形成因子，其可特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖及新生血管形成;缺氧可上調(diào)其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。HIF-1是從缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞核粗提液中提取的一種具有DNA結(jié)合活性的蛋白質(zhì)因子，廣泛參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異應(yīng)答［2］，在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，能誘導(dǎo)VEGF以及一些下游基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致缺血組織的血管新生［3］。因此通過抑制HIF-1α表達(dá)從而抑制其下游VEGF基因的表達(dá)，可能成為抗新生血管治療的一項(xiàng)新措施。

與傳統(tǒng)藥物或特異性抑制劑相比，ASODN直接作用于致病蛋白本身，更具有選擇性，顯示出高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于基因功能的研究和各種疾病的基因治療。本研究以HIF-1α基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了特異性的針對(duì)HIF-1α基因的ASODN序列，并成功轉(zhuǎn)染BREC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染組HIF-1α表達(dá)明顯低于對(duì)照組，證實(shí)HIF-1α ASODN能有效抑制HIF-1α的表達(dá);轉(zhuǎn)染組VEGF表達(dá)上調(diào)被明顯抑制，抑制率明顯高于對(duì)照組，證實(shí)HIF-1α途徑對(duì)缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)具有重要作用。其主要機(jī)制:在VEGF的5'側(cè)翼序列中含有5'-CGTG-3'的缺氧反應(yīng)元件 ，缺氧時(shí) HIF-1α、HIF-1β蛋白質(zhì)均能由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，這一過程稱為核轉(zhuǎn)位，HIF-1α與HIF-1β形成穩(wěn)定的HIF-1，后與靶基因DNA結(jié)合，從而使HIF-1α的C端反式激活結(jié)構(gòu)域激活，誘導(dǎo)p300/CREB結(jié)合蛋白入核并與HIF-1及其他輔激活因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1α ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)被抑制，不能實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，從而打斷了這一途徑，抑制了VEGF的表達(dá)［4］。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單純抑制 HIF-1α途徑尚不能完全阻斷VEGF的表達(dá)，這可能與缺氧還通過其他途徑調(diào)控VEGF的表達(dá)有關(guān)。目前認(rèn)為缺氧除直接促進(jìn)VEGF基因轉(zhuǎn)錄及保持VEGF mRNA的穩(wěn)定性，使VEGF水平上調(diào)外，還有兩種機(jī)制調(diào)控VEGF的表達(dá):①局部自分泌的生長因子，刺激細(xì)胞生長的同時(shí)引起細(xì)胞以旁分泌方式分泌VEGF［5］;② 癌基因、抑癌基因直接參與VEGF的調(diào)控。Mukhopadhyay等［6］發(fā)現(xiàn)野生型p53可反向調(diào)節(jié)VEGF啟動(dòng)子，下調(diào)VEGF mRNA水平。

綜上所述，BREC細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α ASODN后能抑制HIF-1α的表達(dá)，從而降低的VEGF表達(dá)。以HIF-1α為靶點(diǎn)的基因治療有望成為視網(wǎng)膜新生血管性疾病治療的新方向。

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