李均 李瑩瑩

腎臟缺血再灌注損傷(renal isehemia reperfusion injury，RIRI)在臨床上十分常見，可以由外界創(chuàng)傷、腫瘤壓迫、大量失血失液、血管收縮、血栓形成等多種原因引發(fā)。腎臟是對缺血缺氧敏感的器官之一，臨床上RIRI是導(dǎo)致缺血性急性腎功能衰竭及腎移植失敗的主要原因。RIRI的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。既往的研究資料表明它與能量代謝障礙、大量活性氧自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、內(nèi)皮素等多種因素有關(guān)。近年來越來越多的中藥被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究應(yīng)用于缺血再灌注的防治[1]。本實(shí)驗(yàn)選用具有抗氧化作用的虎杖和其主要成分虎杖苷[2]對RIRI進(jìn)行干預(yù)，探討其對RIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

健康清潔級雄性SD大鼠72只(遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重(200±20)g?；⒄蕊嬈徸宰窳x醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院中藥房，虎杖苷粉購自西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞間黏附因子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)免疫組化SABC法試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組及給藥方法

對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖預(yù)處理及虎杖苷預(yù)處理組，每組18只。假手術(shù)組和缺血再灌注組大鼠實(shí)驗(yàn)前1周給予生理鹽水灌胃，虎杖預(yù)處理組在實(shí)驗(yàn)前1周給予濃度為0.4 g(生藥)/ml的虎杖水煎劑2.5 ml灌胃[5 g(生藥)/kg體重]，虎杖苷預(yù)處理組實(shí)驗(yàn)前1周給予濃度為4 mg/ml的虎杖苷細(xì)粉懸濁液2.5 ml灌胃(50 mg/kg體重)。于第7天灌胃1小時后開始手術(shù)。

1.3 缺血再灌注模型的制備與標(biāo)本取材

假手術(shù)組僅麻醉、開腹、暴露雙腎60分鐘后縫合傷口。缺血再灌注組、虎杖預(yù)處理及虎杖苷預(yù)處理組大鼠造模。

根據(jù)文獻(xiàn)制造缺血再灌注大鼠模型[3]，用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，打開腹腔，游離雙側(cè)腎血管，所有大鼠切除右腎，用無損動脈夾夾閉左腎蒂60分鐘,同時向腹腔內(nèi)注射37℃的林格氏液1 ml/100g,后松開動脈夾，若腎臟從紫黑色轉(zhuǎn)為紅色說明模型建立成功，若松開動脈夾5分鐘后未變成正常紅色，說明灌注不成功，應(yīng)棄去,造模成功后縫合傷口，自由進(jìn)食、飲水。

各組分別于缺血前10分鐘、再灌注6小時、再灌注12小時3個時間點(diǎn)采集腎臟及血清標(biāo)本，每組每個時間點(diǎn)6只。

1.4 觀察指標(biāo)

免疫組織化學(xué)染色SABC法測腎組織ICAM-1，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織ICAM-1的表達(dá)情況

ICAM-1在造模大鼠的腎小管和腎間質(zhì)上表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積，各組的ICAM-1有不同程度的表達(dá)。ICAM-1在假手術(shù)組中幾乎無表達(dá)。半定量分析顯示，術(shù)前10分鐘時假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組大鼠腎組織ICAM-1的表達(dá)無明顯差別。再灌注6小時、12小時時，缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理腎組織中ICAM-1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。缺血再灌注組各時間點(diǎn)間比較差異有顯著性(P<0.05)。再灌注6小時、12小時時虎杖及虎杖苷預(yù)處理組腎組織中ICAM-1表達(dá)明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)，虎杖與虎杖苷與處理組無明顯差別(P>0.05)。見圖1、表1。說明腎臟缺血再灌注后虎杖及虎杖苷均能通過減少腎組織ICAM-1的表達(dá)對腎臟起到保護(hù)作用。

2.2 各組大鼠血清中TNF-α含量比較

術(shù)前10分鐘時，假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組大鼠血清中TNF-α含量無明顯差別。于再灌注6小時、12小時時，缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，缺血再灌注組各時間點(diǎn)間比較差異有顯著性(P<0.05)。再灌注6小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)，再灌注12小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量與缺血再灌注組無明顯差異(P>0.05)，見表2。說明再灌注時間延長，血清中TNF-α含量明顯增加，腎組織損傷加重，虎杖及虎杖苷預(yù)處理組再灌注6小時時均以減少血清中TNF-α含量而減輕腎臟缺血再灌注損傷作用，于再灌注12小時則均無明顯效果。

A 假手術(shù)組；B 術(shù)前10min組；C 缺血再灌注6h組；D 缺血再灌注12h組；E 虎杖6h組；F 虎杖12h組；G 虎杖苷6h組；H 虎杖苷12h組

組別術(shù)前10min6h12h假手術(shù)組(n=18)103.43±3.23(n=6)102.56±2.24(n=6)102.34±2.4(n=6)缺血再灌注組(n=18)101.35±4.72(n=6)80.26±3.53ac(n=6)73.23±3.87ace(n=6)虎杖組(n=18)101.56±3.54(n=6)90.11±2.56abc(n=6)86.29±4.75abc(n=6)虎杖苷組(n=18)104.41±1.47(n=6)87.35±5.86abcd(n=6)88.23±6.12abcd(n=6)

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05；與缺血再灌注組比較bP<0.05；與術(shù)前比較,cP<0.05；與虎杖組比較,dP>0.05；與6小時比較，eP<0.05

表2 各組大鼠血清TNF-α含量的比較

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05；與缺血再灌注組比較，bP<0.05; 與術(shù)前比較,cP<0.05；與6小時組比較，dP<0.05

3 討論

ICAM-1即CD54是最早發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族黏附分子之一，是細(xì)胞表面的糖蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一部分。ICAM-1通常在正常的腎小球系膜細(xì)胞、腎血管、腎小管低表達(dá)或無表達(dá)。劉百成等[4]研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后早期ICAM-1表達(dá)以內(nèi)皮細(xì)胞為主，后期腎臟各部均可表達(dá)，腎小管小管上皮尤甚，其表達(dá)量與腎功能惡化程度呈正相關(guān)，提示ICAM-1在腎缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中起促進(jìn)作用。TNF -α主要是由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)中重要的參與物，主要通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性，使活性氧，血小板活化因子等產(chǎn)生增多，引起炎癥損傷，同時促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的釋放，引起炎癥瀑布式放大效應(yīng)。在RIRI中，TNF-α表達(dá)增加。有實(shí)驗(yàn)報道，在RIRI動物模型中應(yīng)用抗TNF-α抗體可對腎臟結(jié)構(gòu)及功能起到有效的保護(hù)作用[5]。

本研究的結(jié)果顯示：腎缺血再灌注后ICAM-1在各組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞有不同程度的表達(dá),尤其在模型組，在假手術(shù)組中幾乎無表達(dá)。說明大量的ICAM-1增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的激活、外滲與浸潤，加劇腎損傷，且腎損傷隨著再灌注時間的延長而加劇?；⒄燃盎⒄溶战M中ICAM-1表達(dá)與缺血再灌注組比較明顯降低。再灌注6小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組均可減少大鼠血清中TNF-α含量而減輕腎臟缺血再灌注損傷作用，但再灌注12小時后則均無明顯效果，其原因可能由于隨著再灌注時間的的延長更多的炎性因子釋放，這些炎性因子誘導(dǎo)炎性瀑布，放大炎性反應(yīng)，而導(dǎo)致藥物的血藥濃度不夠，而使其對再灌注12小時后TNF-α含量無明顯影響。表明虎杖及虎杖苷均可能在腎缺血再灌注損傷中可通過減少ICAM-1的表達(dá)和再灌注后TNF-α含量而起到腎臟保護(hù)作用。

[1]李均, 胡紹進(jìn). 中藥防治腎缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2009, 2(3): 223-225.

[2]郭勝藍(lán)，孫莉莎，歐陽石，等. 虎杖苷對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2005,16(5):414-416.

[3]Mark L.A.,Robinson A.V.,Schulak J.A..Inhibition of nitric oxide synthase reduces renal ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Surgical Research, 2005, 129(2): 236-241.

[4]劉百成，劉耀榮. 大鼠腎缺血再灌注損傷中ICAM-1表達(dá)的變化[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2006, 7(8): 419-421.

[5]韓述嶺，于立新，馬俊杰，等. 抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體減輕腎臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報.2003,23(4): 332-334.