黃筱鈞,唐由凱,杜銀香,袁 杰,胡如華,尹文仲

1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit為天南星科半夏屬植物，其干燥塊莖含有多種有效成分,其中包括生物堿、谷甾酸、多糖、氨基酸、揮發(fā)油、半夏蛋白及無機(jī)元素等，藥用歷史悠久,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)等功效,是中國的傳統(tǒng)中藥[1～3]。湖北恩施有華中藥庫之稱，盛產(chǎn)半夏。近年來隨著半夏的應(yīng)用越來越廣泛和人們對其野生資源的過度開采，以及化肥、農(nóng)藥及化學(xué)殺菌(蟲)劑的廣泛使用，嚴(yán)重破壞了半夏生長的內(nèi)外微生態(tài)環(huán)境，根腐病的發(fā)生十分嚴(yán)重，使得半夏的產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低。雖然，一些半夏種植基地采用殺菌、輪作等方法，但實際效果并不十分理想，必須尋找新的解決方法[4]。近年來，由于微生態(tài)學(xué)的興起，人們試圖應(yīng)用生態(tài)學(xué)原理去研究生物的生存環(huán)境(宏觀和微觀環(huán)境)及其相互影響[5]。植物微生態(tài)學(xué)就是其中的一個重要分支，它是研究植物內(nèi)生菌與植株相互關(guān)系的科學(xué)[6]。本文從半夏植株內(nèi)分離培養(yǎng)出內(nèi)生菌，通過革蘭氏染色鏡檢和生化反應(yīng)實驗證明其符合地衣芽胞桿菌的特征，對研究、制備半夏益生菌制劑將有著重要意義。

1 材料與方法

1.1樣本采集植物來源：半夏植株采自湖北省建始縣紅巖寺鎮(zhèn)半夏種植和研究基地。樣本采集方法：選擇半夏種植地生長好、無倒伏植株，并進(jìn)行編號、登記。

1.2儀器設(shè)備和試劑超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、高壓蒸氣滅菌鍋、水浴鍋、振蕩器、培養(yǎng)箱、革蘭氏染色液一套。

1.3培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂25 g、蒸餾水1000 ml。培養(yǎng)基制備方法：將瓊脂加熱化開，加牛肉膏和蛋白胨，再加熱溶解調(diào)pH值至7.4，分裝試管置高壓滅菌鍋內(nèi)在0.1 Mpa壓力下滅菌30 min，冷卻后制成固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基(去瓊脂)備用。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理及接種 分別取新鮮半夏的塊莖、株芽、莖三類標(biāo)本先用自來水沖洗24 h，后進(jìn)行表面消毒處理：無菌水沖洗3遍，0.5%的漂白粉液表面消毒5 min，再用無菌水沖洗4次。取組織10 g無菌操作剪碎，加入40 ml無菌水和裝有10粒滅菌玻璃珠的三角燒瓶中，經(jīng)300r/min轉(zhuǎn)振蕩10 min，靜置30 s，用滅菌吸管取5 ml上清液注入滅菌試管中備用，80℃水浴鍋內(nèi)恒溫處理20 min，用接種環(huán)取一環(huán)上清液接種至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，35℃下培養(yǎng)24～72 h后觀察結(jié)果。

1.4.2 內(nèi)生菌的分離 經(jīng)24～72 h培養(yǎng)后，挑選不同類型的菌落涂片，革蘭氏染色，油鏡觀察，初步確定目的菌，再純化培養(yǎng)。

1.4.3 生化反應(yīng) 對分離子的內(nèi)生菌進(jìn)行生化反應(yīng)實驗。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)特性半夏的塊莖、株芽、莖分別經(jīng)前處理后再各自接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后三類標(biāo)本在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征如下：菌落呈圓形灰白色光滑，直徑3～4 mm，中央凹陷，邊緣隆起，呈肚臍狀(見圖1)；在液體培養(yǎng)基中呈混濁狀，培養(yǎng)24 h后形成沉淀，沉于管底，上液澄清。在血平板上生長24 h無溶血環(huán)。

圖1 菌落形態(tài)特征的照片圖

2.2涂片染色鏡檢三類標(biāo)本分別進(jìn)行涂片、染色和鏡檢。

2.2.1 涂片染色 三類標(biāo)本分別進(jìn)行涂片，方法如下，用滅菌接種環(huán)在菌落邊緣蘸取少許菌體，置盛有10 ml無菌生理鹽水的試管內(nèi)振蕩，制成細(xì)菌懸浮液，再用無菌小吸管取細(xì)菌懸液2滴，加在潔凈玻片上，使菌液自然干燥后，火焰固定。三張標(biāo)本片分別進(jìn)行革蘭氏染色。

2.2.2 光學(xué)顯微鏡檢查 三張標(biāo)本片油鏡檢查結(jié)果相同。菌體呈直桿狀，成鏈狀排列，菌體長5～10 μm，寬1～2 μm，革蘭氏染色陽性呈紫色，細(xì)菌培養(yǎng)24 h后染色鏡檢無芽胞形成，培養(yǎng)48 h后才可見芽胞形成，芽胞呈柱狀，中生，無莢膜。

2.3生化反應(yīng)結(jié)果對分離出的內(nèi)生菌進(jìn)行較詳細(xì)的生化反應(yīng)實驗，結(jié)果見表1。

表1 內(nèi)生菌生化反應(yīng)實驗結(jié)果

續(xù)表1

2.4鑒定根據(jù)以上試驗結(jié)果，所分離出的半夏內(nèi)生菌菌株符合地衣芽胞桿菌的特征。

3 討論

3.1本研究的理論基礎(chǔ)近年來微生態(tài)學(xué)研究發(fā)展十分迅速，植物微生態(tài)學(xué)是其中重要分支，它是研究植物內(nèi)生菌與植物相互關(guān)系的一門學(xué)科[4]。植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或整個階段都生活在健康植物各種組織器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的微生物。目前，從廣義上來講，植物內(nèi)生菌泛指所有生活在植物內(nèi)部的微生物[7]。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的種類主要有：內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌[8]。其中芽胞桿菌就是植物體內(nèi)的重要內(nèi)生菌，它們不僅可存在于植物內(nèi)部，也常見于土壤中[6]。

3.2菌株符合地衣芽胞桿菌特征本試驗所分離的半夏內(nèi)生菌菌株符合地衣芽胞桿菌的特征，依據(jù)如下：半夏植株樣品經(jīng)自來水沖洗，漂白粉表面消毒，80℃水浴鍋內(nèi)恒溫處理20 min后絕大部分無芽胞菌均被殺死，剩下的是耐熱的芽胞菌；在固體培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，灰白色，光滑，直徑3～4 mm，邊緣隆起，中央凹陷，呈肚臍狀，在液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后形成沉淀，沉于管底，上液澄清；培養(yǎng)物涂片再經(jīng)革蘭氏染色后油鏡觀察：菌體呈直桿狀，成鏈狀排列，菌體長5～10 μm，寬1～2 μm，革蘭氏染色呈陽性，菌體紫色，細(xì)菌經(jīng)48 h培養(yǎng)后可見芽胞形成，位于菌體中央(中生)芽胞呈柱狀。依據(jù)文獻(xiàn)確定該菌株為地衣芽胞桿菌[6]。

3.3半夏有益內(nèi)生菌研究的意義自從半夏從野生轉(zhuǎn)家生之后，由于化肥、農(nóng)藥及化學(xué)殺菌(蟲)劑的使用，嚴(yán)重破壞了半夏生長的內(nèi)外微生態(tài)環(huán)境，使半夏易患根腐病、抗性下降等，半夏畝產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低。究其原因，是半夏微生態(tài)平衡失調(diào)所造成，雖然國內(nèi)外許多學(xué)者從事植物(主要是農(nóng)作物)微生態(tài)學(xué)的研究，但目前為止，還未見半夏微生態(tài)學(xué)研究的報道。因此，應(yīng)用微生態(tài)學(xué)原理和方法來研究半夏的微生態(tài)平衡及微生態(tài)失調(diào)，并且利用從半夏植株體內(nèi)分離出來的有益內(nèi)生菌制成半夏益生菌制劑，再將半夏益生菌回歸原生境，對半夏進(jìn)行微生態(tài)防護(hù)，以達(dá)到對半夏防病治病和植物保健的功效，從而提高半夏的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。下一步將進(jìn)行半夏菌株的安全試驗、生物拮抗試驗、菌液的制備、室內(nèi)生物測定和田間生物測定等，使半夏益生菌早日問世，為建立半夏的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)種植技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 肖培根.新編中藥志(第1卷)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:372.

[2] 冉懋雄.名貴中藥材綠色栽培技術(shù)[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2002:12.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:78.

[4] 胡琴.半夏研究和開發(fā)最新進(jìn)展及其思考[J].西南科技大學(xué)報,2005,20(1):63.

[5] 康白.微生態(tài)學(xué)原理[M].大連:大連出版社,2002:38.

[6] 康白.微生態(tài)學(xué)[M].大連:大連出版社,1998:41.

[7] 李強(qiáng).植物內(nèi)生菌的開發(fā)與研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2006,3:33.

[8] 文才藝.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題[J].生態(tài)學(xué)雜志,2004,23(2):86.

[9] 孫力軍，陸兆新.植物內(nèi)生菌抗菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(2):78.