胡 敏 張凱倫 項(xiàng)飛翔

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 1心臟外科 2超聲影像科,武漢 430022 3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心胸外科,武漢 430030

靜脈橋再狹窄是影響冠狀動(dòng)脈旁路移植(coronary artery bypass graft,CABG)術(shù)后遠(yuǎn)期療效的主要因素。目前研究表明,血管平滑肌細(xì)胞的增殖、移行是血管再塑和重排,并最終導(dǎo)致移植靜脈再狹窄或閉塞的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1]。基因治療作為一種在分子水平干擾和糾正疾病的治療手段,在移植靜脈橋再狹窄的防治上有良好的應(yīng)用前景。研究表明超聲輻照結(jié)合微泡造影劑可促進(jìn)裸質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞中[2-3]。本研究運(yùn)用微泡造影劑結(jié)合超聲輻照介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP)轉(zhuǎn)染移植靜脈,探討該方法的有效性、可行性,為臨床預(yù)防CABG術(shù)后再狹窄的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠40只,清潔級(jí),體重200～250 g,雄性,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供,許可證號(hào):SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2 質(zhì)粒提取 pEGFP菌液由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室朱濤博士提供,pEGFP經(jīng)大腸埃希菌擴(kuò)增后,按質(zhì)粒大量抽提試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明提取。提取純化的pEGFP酶切電泳鑒定,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為 1 mg/mL,A260/A280＞1.8。

1.1.3 微泡造影劑 微泡造影劑Sono Vue(意大利Bracco公司產(chǎn)品),主要成分為六氟化硫(SF6)氣體和白色凍干粉末。使用時(shí)將5 mL生理鹽水注入Sono Vue藥瓶中,用力振蕩使藥物混合均勻,微泡造影劑濃度為(1～2)×109微泡/mL,微泡直徑2～6 μ m 。

1.1.4 超聲照射系統(tǒng) 美國(guó)ACUSON公司的Sequoia 512,選用15L8W探頭。特制輻照容器:聚乙烯管,長(zhǎng)約1.5 cm,直徑2 cm,表面以聚乙烯薄膜封口。

1.1.5 熒光顯微鏡 Nikon 80i熒光顯微鏡:激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,接收波長(zhǎng)530 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型建立 動(dòng)物隨機(jī)分4組(10只/組),即A 組:單純質(zhì)粒浸泡組;B組:質(zhì)粒+微泡造影劑組;C組:質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組;D組:質(zhì)粒+微泡造影劑+超聲輻照組。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫18～25℃,濕度65%～70%,自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物模型建立:大鼠以10%水合氯醛水溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,同時(shí)腹腔注射肝素10 U/100 g,作右側(cè)頸部縱切口,取頸外靜脈段約2.0 cm,以間斷縫合法間置植于頸總動(dòng)脈,建立頸外靜脈頸總動(dòng)脈旁路移植模型。術(shù)后當(dāng)天肌肉注射青霉素20萬(wàn)單位,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒與微泡造影劑混合液的配制 一次性注射器抽取5 mL生理鹽水,注入Sono Vue微泡造影劑安瓿中,充分搖勻備用;取pEGFP溶液1 mL(質(zhì)粒濃度1 mg/mL),將其加入上述造影劑安瓿中,搖勻后4℃下靜置30 min,使pEGFP充分粘附于微泡的外殼。

1.2.3 超聲輻照 取大鼠頸外靜脈段長(zhǎng)約 2.0 cm,將靜脈段置入含有相應(yīng)液體的特制輻照容器中,小心以聚乙烯薄膜封口,盡量不留可見(jiàn)氣泡,給予超聲輻照或僅將探頭置于容器上不開(kāi)啟超聲儀器(超聲探頭與聚乙烯薄膜之間以耦合劑密閉)。輻照參數(shù):探頭頻率固定為10 MHz,機(jī)械指數(shù)為1.9,輻照時(shí)間為10 min。動(dòng)物隨機(jī)分為上述4組各10只,將處理后的靜脈段間置吻合于頸總動(dòng)脈,建立頸外靜脈頸總動(dòng)脈旁路移植模型。待大鼠蘇醒后送回動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2.4 觀察報(bào)告基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染 pEGFP 7 d后,取出移植靜脈段,經(jīng)固定劑固定15 min后置于恒冷箱切片機(jī)凍臺(tái)上行冷凍切片,將組織橫切為厚度為7 μ m的薄片。使用Nikon 80i熒光顯微鏡在490 nm波長(zhǎng)紫外光激發(fā)下觀察報(bào)告基因在靜脈組織中的表達(dá)。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,每個(gè)視野取3個(gè)熒光強(qiáng)度最亮的區(qū)域作熒光強(qiáng)度比較。數(shù)據(jù)采集由NIS-Elements BR(Nikon)軟件完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因pEGFP的表達(dá)

轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒7 d后,D組可見(jiàn)明顯特異性綠色熒光,主要位于血管平滑肌層,C組也有少量的表達(dá);而A組和B組則無(wú)表達(dá)(圖1)。同時(shí)對(duì)各組血管組織進(jìn)行了蘇木精-伊紅染色,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何形式的壞死出現(xiàn)(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因pEGFP的表達(dá)Fig.1 The expression of pEGFP in vascular smooth muscle cells examined by fluorescence microscopy

圖2 質(zhì)粒+微泡造影劑+超聲輻照組血管組織蘇木精-伊紅染色(×200)Fig.2 Vascular tissue hematoxy lin-eosin(HE)staining in plasmid+microbubble contrast agents+irradiation group(g roup D)(×200)

2.2 各組綠色熒光強(qiáng)度比較

A組熒光強(qiáng)度為(2.20±0.25),B組為(3.35±0.73),C組為(13.23±1.55),D組為(45.78±5.81)。D組pEGFP的熒光強(qiáng)度顯著高于其他各組(均 P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組間熒光強(qiáng)度比較Fig.3 Comparison of fluo rescence intensity among the four groups

3 討論

CABG是目前治療缺血性心臟病的重要手段,人體大隱靜脈(human saphenous vien,HSV)具有取材容易、長(zhǎng)度充分、口徑大易吻合等優(yōu)點(diǎn),目前仍是冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)中常用的一種血管材料。然而HSV的遠(yuǎn)期通暢率卻較動(dòng)脈橋低,其術(shù)后第1年阻塞率為15%,之后阻塞率逐年遞增1%～4%,10年通暢率僅60%左右[4]。CABG術(shù)后靜脈橋再狹窄是影響冠心病治療效果的一個(gè)決定性因素?？刂苾?nèi)膜和平滑肌增生、防治血管損傷后再狹窄是當(dāng)今世界多個(gè)學(xué)科共同研究的重要課題。CABG手術(shù)中,患者的大隱靜脈被暫時(shí)性取出體外,為有效的靶向基因治療提供了一個(gè)獨(dú)特的時(shí)機(jī)。如何將外源基因高效地轉(zhuǎn)入靜脈組織中是目前基因治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

目前將外源性基因轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞的方法主要有病毒載體轉(zhuǎn)染與非病毒載體轉(zhuǎn)染兩大類,前者具有較高的轉(zhuǎn)染效率,但存在免疫反應(yīng)、細(xì)胞毒性與安全性等問(wèn)題;而后者具有安全、簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì),但存在轉(zhuǎn)染效率低的弱點(diǎn)。超聲微泡型造影劑由于其特殊的構(gòu)造,能有效吸附基因載體。國(guó)內(nèi)外近年的研究表明,微泡造影劑可以作為一種新型的基因載體,具有減少降解、具備靶向性,并兼有明顯提高透膜轉(zhuǎn)染率的特點(diǎn)[5-6]。其基本原理為:聲場(chǎng)內(nèi)的超聲波破壞微泡造影劑后,其產(chǎn)生的空化和機(jī)械效應(yīng)一方面引起微循環(huán)結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬,另一方面可導(dǎo)致短暫的細(xì)胞多孔化,使細(xì)胞膜通透性增加[7-8]。有研究顯示:微泡強(qiáng)化的空化作用可顯著提高體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染水平約300倍[9]。

本研究以Sono vue作為EGFP基因載體,結(jié)合靶組織的超聲輻照,熒光顯微鏡下顯示移植靜脈橋組織細(xì)胞內(nèi)EGFP明顯多于質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組;而單純pEGFP組及單純質(zhì)粒+微泡組不進(jìn)行超聲輻照時(shí)未見(jiàn)EGFP表達(dá),這2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明單純微泡本身在基因轉(zhuǎn)染中并不發(fā)揮直接作用,而是結(jié)合了超聲輻照才可有效增加細(xì)胞膜的通透性,提高基因的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)對(duì)輻照后的血管組織進(jìn)行了蘇木精-伊紅染色,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何形式的壞死出現(xiàn),這提示在此條件下的超聲輻照及其破壞微泡所產(chǎn)生的各種效應(yīng)并未對(duì)血管組織產(chǎn)生致死性損傷,這為將來(lái)此種方法的臨床應(yīng)用提供了安全的保證。

本研究表明超聲輻照結(jié)合微泡造影劑能有效提高基因在移植靜脈中的轉(zhuǎn)染,且相對(duì)安全,有望在為移植靜脈再狹窄的基因防治中發(fā)揮作用。但本研究?jī)H以報(bào)告基因?yàn)檠芯繉?duì)象,欲真正實(shí)現(xiàn)基因治療尚須大量細(xì)致的研究。

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