許 文，李心群

(溫州醫(yī)學院1.微生物學與免疫學教研室，2.附屬第一醫(yī)院急診科，浙江溫州 325035)

豬苓為多孔菌科真菌豬苓〔Polyporus umbellatus(Pers.)Fries〕的干燥菌核，具有利尿和抗腫瘤活性［1－2］。豬苓多糖(polyporus polysaccharides，PPS)是從豬苓中提取的多糖類物質(zhì)，具有抗癌瘤、增強免疫功能、保護肝臟和修復肝組織損傷等作用，PPS注射液已用于肝炎及腫瘤的輔助治療［2－4］。目前對PPS的作用機制尚未闡明。為探討其作用機制，本研究觀察了PPS對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)、白細胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的影響，并制備了熒光胺(fluoresceinamine，F(xiàn)lu)標記的PPS(Flu-PPS)，以嘗試確定PPS所識別的靶分子，為進一步研究其藥理作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因野生型、對脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)敏感的小鼠C3H/HeN和TLR4基因突變、對LPS不敏感的C3H/HeJ小鼠，雌性，6～8周，購自中國科學院上海實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2007-0005。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)CS)和 RPMI 1640培養(yǎng)基為 Hyclone產(chǎn)品;小鼠 IL-1β和 TNF-α ELISA試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品;LPS鱟試劑及NO檢測試劑盒購自Sigma公司;抗小鼠TLR4和TLR2單抗及抗補體受體CR3單抗CD11b購自eBiosciences公司，上述抗體在用于細胞培養(yǎng)之前均用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析以去除其中的疊氮鈉;RPMI 1640完全培養(yǎng)基:以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎，加入10%的滅活 FCS，青霉素62.5 mg·L－1及鏈霉素100 g·L－1;陰性對照多糖——葡聚糖(dextran)，相對分子質(zhì)量70 000，購自Sigma公司;硫代羥基乙酸鈉(thioglycollate，TG)為北京生物制品研究所產(chǎn)品。流式細胞儀，F(xiàn)ACScan，美國B＆D公司;Bio-Rad Model 550酶標儀，美國伯樂公司;激光共聚焦顯微鏡，Leica TCS SP2，德國Leica公司。

1.2 PPS 的制備

采用水浸提-乙醇沉淀提取法提取 PPS［5］。粉碎的豬苓用熱水浸提，索氏提取器抽濾。濾液經(jīng)濃縮后用乙醇沉淀，沉淀物依次經(jīng)乙醇、丙酮和乙醚洗滌后，用Sevage法去除蛋白質(zhì)。所得粗多糖用水透析，凍干保存。苯酚-硫酸法檢測多糖含量＞95%。劉小平等［5］用紫外與紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，PPS表現(xiàn)出β-D-葡萄吡喃糖的特征吸收;氣相色譜分析表明，其主要由D-葡萄糖和少量的D-半乳糖和D-甘露糖組成，經(jīng)尺寸排除色譜和激光光散射聯(lián)用儀測得PPS平均相對分子質(zhì)量為1.6×105，分子質(zhì)量分布(重均分子質(zhì)量/數(shù)均分子質(zhì)量)為2.914。經(jīng)鱟試劑法檢測，PPS 中 LPS 含量 ＜0.4 μg·g－1。

1.3 PPS及葡聚糖的熒光標記

Flu-PPS及Flu-葡聚糖采用溴化氰活化的方法制備［6］，即0.2 ml溴化氰 50 g·L－1加于 1 ml PPS或葡聚糖 (20 g·L－1)，用 NaOH 0.2 mol·L－1調(diào) pH至 11.0，反應15 min，然后以 pH 8.0 硼酸鹽緩沖液透析20 h?；罨腜PS或葡聚糖與2 mg Flu反應10 h后，葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)柱層析分離標記多糖，得到 Flu-PPS和 Flu-葡聚糖。PPS，F(xiàn)lu-PPS，葡聚糖和Flu-葡聚糖均溶于RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存。

1.4 脾細胞增殖反應的測定

頸椎脫臼處死2種小鼠，無菌條件下分別取脾臟，制成脾細胞懸液，裂解紅細胞，用RPMI 1640調(diào)整細胞密度為4 ×109L－1，于96 孔板每孔加入100 μl，分別與不同濃度的葡聚糖、PPS或Flu-PPS于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，于終止培養(yǎng)前8 h，每孔加入5.4 Bq［3H］TdR，收集細胞于玻璃纖維濾紙，β-粒子計數(shù)器測定放射活性(cpm)，每樣品3個復孔。

1.5 小鼠腹腔巨噬細胞的制備

小鼠腹腔注射3%TG溶液，每只2 ml，72 h后脫頸椎處死，收集腹腔洗液，貼壁2 h，去除非貼壁細胞，即為所需腹腔巨噬細胞。調(diào)細胞密度為2×106L－1，錐蟲藍染色法檢查細胞存活率＞95%。

1.6 Griess法檢測C3H/HeN小鼠腹腔巨細胞培養(yǎng)上清一氧化氮濃度

C3H/HeN小鼠腹腔巨細胞與PPS(終濃度為12.5，25，50 和 100 mg·L－1)，LPS 1 mg·L－1或葡聚糖50 mg·L－1作用24 h后，檢測上清中亞硝酸鹽含量。

1.7 ELISA法檢測C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨細胞培養(yǎng)上清IL-1β及TNF-α含量

分別取C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細胞2×106加于 24孔板內(nèi)，分別與葡聚糖 50 mg·L－1，LPS 1 mg·L－1或不同濃度 PPS(終濃度為12.5，25，50 和100 mg·L－1)于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作，檢測上清中IL-1β及TNF-α含量。

1.8 抗體中和實驗

取C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞先分別與抗TLR4，TLR2 及 CR3 單抗 20 mg·L－1作用 1 h，再加入 PPS 50 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，檢測上清中IL-1β和TNF-α含量。

1.9 流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡分析C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞表面PPS識別靶分子

收集C3H/HeN小鼠腹腔巨細胞，用PBS調(diào)整細胞密度為1×109L－1，加入Eppendorf管離心，于細胞沉淀中加入50 μl Flu-PPS或 Flu-葡聚糖 1 mg·L－1，4℃冰箱中避光反應30 min，用 PBS 洗2次，激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測細胞表型(CellQuest軟件分析)。竟爭抑制實驗時，腹腔巨噬細胞先與未標記的 PPS 100 mg·L－1或抗 TLR4，TLR2 或 CR3 單抗 200 mg·L－1反應 30 min，再與Flu-PPS或Flu-葡聚糖反應。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PPS對C3H/HeN小鼠脾細胞增殖反應的影響

如圖1所示，與RPMI 1640對照組相比，PPS具有促進C3H/HeN小鼠脾細胞增殖的作用，［3H］TdR摻入值明顯增高，在 12.5 ～50 mg·L－1濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴效應(r=0.999，P＜0.01);葡聚糖對脾細胞增殖反應無促進作用。經(jīng)鱟試劑法檢測，PPS 中 LPS 含量 ＜0.4 μg·g－1，排除了這種作用是由于PPS樣品受到LPS的污染所致。

另外，為了檢測經(jīng)熒光標記后，PPS的活性是否發(fā)生了改變，同時觀察了Flu-PPS對C3H/HeN小鼠脾細胞增殖反應的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS對小鼠脾細胞增殖反應的促進作用與PPS相近(圖1)，在12.5 ～ 50 mg·L－1濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴效應(r=0.999，P ＜0.01)，表明 Flu 標記對 PPS 的免疫活性無明顯影響，可用于后續(xù)實驗。

圖1 豬苓多糖(PPS)和熒光胺(Flu)標記的PPS(Flu-PPS)對C3H/HeN小鼠脾細胞增殖反應的影響.C3H/HeN小鼠脾細胞分別與不同濃度的PPS，F(xiàn)lu-PPS或葡聚糖孵育，對照組以等體積的RPMI 1640培養(yǎng)基代替受試藥物，孵育72 h后用［3H］TdR摻入法測定放射活性.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與RPMI 1640組比較.Fig.1 Effects of polyporus polysaccharides(PPS)and fluoresceinamine(Flu)labeledPPS(Flu-PPS)on splenocyte proliferation of C3H/HeN mice.

2.2 PPS對C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞NO，IL-1β和TNF-α產(chǎn)生的影響

PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1與 C3H/HeN 小鼠腹腔巨噬細胞孵育24 h后，細胞培養(yǎng)上清中NO，IL-1β和TNF-α濃度與RPMI 1640組比較明顯增加(表 1)，具有濃度依賴效應 (NO:r=0.858，P ＜0.01;IL-1β:r=0.936，P ＜ 0.01;TNF-α:r=0.903，P ＜0.01)，表明 PPS 具有活化巨噬細胞的作用。由于這3種活性物質(zhì)與巨噬細胞的細胞毒活性相關，因此推測PPS可能通過激活巨噬細胞產(chǎn)生NO，IL-1β和TNF-α等細胞因子發(fā)揮抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。

2.3 抗TLR4單抗對PPS促進C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β和TNF-α的抑制作用

在加入PPS 50 mg·L－1前，加入抗TLR4單抗20 mg·L－1作用1 h，C3H/HeN 小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中 IL-1β 和TNF-α 濃度與 PPS 50 mg·L－1單用組比較明顯降低，降幅達 52.6% 和 58.6%(P＜0.01);而同型抗體(IgG1)、抗 TLR2及 CR3單抗分別與腹腔巨噬細胞預孵育，培養(yǎng)上清中IL-1β和TNF-α濃度與PPS 50 mg·L－1單用組比較無明顯差異;提示PPS可能經(jīng)TLR4促進腹腔巨噬細胞產(chǎn)生 IL-1β 和 TNF-α(表2)。

2.4 PPS對C3H/HeN和 C3H/HeJ小鼠脾細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β和TNF-α的影響

由表3～表5所示，為了探討PPS促進脾細胞增殖反應和活化巨噬細胞的作用是否通過TLR4發(fā)揮作用，比較了PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ脾細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的影響。結(jié)果表明，PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠脾細胞增殖反應均具促進作用(P＜0.01)，并促進腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α。PPS對C3H/HeN小鼠的促進作用明顯強于 C3H/HeJ小鼠是 PPS 12.5 ～100 mg·L－1組，脾細胞增殖反應增加了 2.4，1.7，1.5 和 22.2倍，IL-1P 產(chǎn)生分別增加了 0.9，1.3，1.2 和 1.1倍，TNF-α 產(chǎn)生分別增加了 1.3，0.9，0.6 和 0.6倍。由于C3H/HeJ小鼠屬于TLR4受體缺陷小鼠，不能通過TLR4傳導信號，故本結(jié)果進一步提示PPS可能是通過TLR4發(fā)揮對脾細胞和巨噬細胞的活化作用。

表1 PPS對C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)，白細胞介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響Tab.1 Effect of PPS on production of nitric oxide(NO)，interleukin-1β(IL-1β)and tumor neceosis factor-α (TNF-α)by peritoneal macrophages of C3H/HeN mice

表2 抗Toll樣受體4(TLR4)單抗對PPS刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的影響Tab.2 Effect of anti-Toll like receptor 4(TLR4)monoclonal antibody on promotion of PPS on IL-1β and TNF-α production of peritoneal macrophages of C3H/HeN mice

表3 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠脾細胞增殖反應的影響Tab.3 Effects of PPS on splenocyte proliferation of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

表4 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β的影響Tab.4 Effects of PPS on IL-1β production of peritoneal macrophages of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

表5 PPS對C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的影響Tab.5 Effects of PPS on TNF-α production of peritoneal macrophages of C3H/HeN and C3H/HeJ mice

2.5 PPS在C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞表面識別的靶分子

為進一步證實小鼠腹腔巨噬細胞表面具有PPS識別的靶分子，觀察了Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合。Flu-PPS和Flu-葡聚糖分別與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞孵育30 min。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細胞結(jié)合的平均熒光強度明顯強于 Flu-葡聚糖組，且 Flu-PPS 5 mg·L－1時熒光強度并未明顯增加(圖2)，表明PPS與腹腔巨噬細胞的結(jié)合具有飽和性，提示巨噬細胞表面具有PPS識別的靶分子。激光共聚焦顯微鏡分析亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu-PPS與巨噬細胞孵育后在巨噬細胞表面形成了綠色的熒光環(huán)(圖3)。

圖2 Flu-PPS與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞表面特異結(jié)合.小鼠腹腔巨噬細胞分別與Flu-PPS或Flu-葡聚糖4℃避光反應30 min后，流式細胞儀分析與巨噬細胞結(jié)合的熒光強度.Fig.2 Specific binding of Flu-PPS to peritoneal macrophages of C3H/HeN mice.

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測Flu-PPS與Flu-葡聚糖與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞結(jié)合.A:Flu-PPS;B:Flu葡聚糖.Fig.3 Binding of Flu-PPS or Flu-dextran with peritoneal macrophages of C3H/HeN mice observed using confocal laser-scanning microscope.

為證實Flu-PPS與巨噬細胞膜表面分子作用的特異性，本研究進行了一系列的阻斷實驗。結(jié)果顯示，過量的未標記的PPS 100 mg·L－1可抑制Flu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細胞的結(jié)合(圖4A);另外，抗TLR4單抗可顯著抑制Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合(圖4B)，而抗TLR2及補體受體CR3單抗則無明顯的抑制作用(圖4C)。結(jié)合2.3及2.4結(jié)果可以表明，巨噬細胞表面存在PPS結(jié)合的靶分子，TLR4可能是其主要的靶分子。由于與未標記的PPS的抑制作用比較，抗TLR4抗體的阻斷作用相對較弱，表明巨噬細胞表面可能還存在其他的靶分子。

圖4 PPS與抗TLR4單抗抑制Flu-PPS與C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞的結(jié)合.小鼠腹腔巨噬細胞與PPS 100 mg·L－1及抗TLR4，TLR2或補體受體CR3單抗200 mg·L－14℃孵育1 h，PBS洗滌后加入Flu-PPS 1 mg·L－1，繼續(xù)反應30 min后，流式細胞儀分析顯示未標記的PPS(A)及抗TLR4單抗(B)可顯著抑制Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合，而抗TLR2及CR3單抗則無明顯抑制作用(C).Flu-葡聚糖組只加入Flu-葡聚糖 1 mg·L －1，反應 30 min 后檢測.Fig.4 Inhibition of Flu-PPS binding to peritoneal macrophages of C3H/HeN mice by unlabeled PPS and anti-mouse TLR4 monoclonal antibody.

3 討論

PPS是從豬苓中提取出的水溶性多糖，具有廣泛的生物學活性。動物實驗研究結(jié)果表明，PPS可使小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能增強，增強T細胞增殖，促進B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞，并具有抑制腫瘤生長和增強免疫功能的作用［2，4］。本研究結(jié)果表明，PPS具有促進小鼠脾細胞增殖及腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO，IL-1β及TNF-α的活性，且這種活性與TLR4有關。

由于LPS具有很強的活化巨噬細胞的作用，亦能夠促進巨噬細胞產(chǎn)生NO及各種細胞因子。為了排除樣本中可能的LPS污染，本研究采用鱟試劑法檢測了PPS中LPS的含量，發(fā)現(xiàn)樣本中LPS含量遠低于活化巨噬細胞所需的濃度，并不足以干擾實驗結(jié)果。

中藥多糖生物活性的發(fā)揮可能有賴于與細胞上相應受體的相互作用，而巨噬細胞在固有免疫及獲得性免疫反應中均發(fā)揮重要作用。因此，發(fā)現(xiàn)并研究巨噬細胞表面中藥多糖受體和細胞內(nèi)信號傳導途徑，對揭示中藥多糖免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用機制具有重要的理論及實際應用價值。

已有研究表明，巨噬細胞功能的發(fā)揮與其表面所謂的模式識別受體(pattern recognition receptor)如TLR4，TLR2，CR3，甘露糖受體及dectin-1等有關。TLR4可結(jié)合多種病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns)而活化。TLR活化后，可以促進機體抗感染和抗癌活性，如促進巨噬細胞NO的釋放，并且可以通過誘導IL-1β和TNF-α等細胞因子調(diào)節(jié)特異性免疫應答。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的多糖可以通過TLR4介導多種免疫細胞激活細胞內(nèi)信號通路，活化轉(zhuǎn)錄，促進細胞因子的釋放，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。如紅花多糖［8］和刺五加多糖［9］等可通過TLR4活化腹腔巨噬細胞導致NO和TNF-α的產(chǎn)生，且與 NF-κB 的活化有關。Hsu 等［10－11］研究表明，靈芝多糖亦可通過TLR4活化小鼠腹腔巨噬細胞及誘導樹突狀細胞表型與功能成熟。因此，天然來源的多糖作為TLR的候選配體在治療感染性疾病和癌癥方面具有廣闊的前景。

基于以上發(fā)現(xiàn)與研究，筆者推測PPS也可通過與TLR4作用來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。為確定此假設，本研究比較了PPS對C3H/HeN小鼠和TLR4基因缺陷的C3H/HeJ小鼠脾細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO，IL-1β及TNF-α的影響。結(jié)果表明，PPS 12.5，25，50 及 100 mg·L－1能顯著刺激C3H/HeN小鼠脾細胞增殖，并促進其腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO，IL-1β 及 TNF-α;對 C3H/HeJ小鼠脾細胞增殖及腹腔巨噬細胞細胞因子的分泌具有一定的促進作用，但明顯弱于對C3H/HeN小鼠的促進作用;由此提示，PPS活性與TLR4有關。用抗TLR4抗體封閉后，PPS刺激腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β及TNF-α的作用下降達52.6%和58.6%，進一步表明PPS的活性與TLR4有關。

另外，流式細胞儀分析結(jié)果表明，F(xiàn)lu-PPS 1 mg·L－1與巨噬細胞結(jié)合的熒光強度明顯高于Flu-葡聚糖，增加Flu-PPS的濃度熒光強度并未相應地增強，表明PPS與靶分子的結(jié)合具有飽和性;并且未標記的PPS 100 mg·L－1能阻斷Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合，表明巨噬細胞上具有PPS結(jié)合的靶分子，與激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抗TLR4抗體能夠阻斷Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合，表明TLR4可能是PPS結(jié)合的靶分子。因此推測，PPS可能通過TLR4激活小鼠腹腔巨噬細胞以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

PPS對C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO及細胞因子并非完全沒有影響，抗TLR4抗體也未能完全阻斷Flu-PPS與巨噬細胞的結(jié)合，提示除了TLR4之外，巨噬細胞表面可能還存在其他的PPS結(jié)合的靶分子，這一推測尚待進一步研究。另外，本研究是用溴化氰活化的方法對PPS進行了熒光標記，雖然Flu-PPS與PPS比較其免疫活性未發(fā)生明顯變化，但該標記方法主要是活化多糖上的羥基，沒有選擇性，多糖熒光標記后是否會改變多糖的活性位點，是否會使多糖的活性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，亦尚待進一步研究。

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