李志勇，孫建寧，張碩峰

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 100102;2.中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

次烏頭堿(hypaconitine，HA)是烏頭類植物中3種主要的雙酯型生物堿之一，與烏頭堿類似，含有14位苯甲酸酯及8位醋酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)［1］。HA對小鼠的LD50弱于烏頭堿和中烏頭堿，而烏頭堿與中烏頭堿的毒性相似［2］。對15種附子炮制品的烏頭堿、中烏頭堿和HA含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，三者含量差異懸殊，部分炮制品的烏頭堿和中烏頭堿含量低于極限檢測水平，而HA在15種受檢炮制品中仍能檢出，只是含量較低，推測烏頭堿、中烏頭堿和HA在附子炮制過程中均易分解，烏頭堿對熱最不穩(wěn)定，而HA在炮制過程中的分解速度相對緩慢［3－4］。邊寶林等［5］還發(fā)現(xiàn)，附子在煎煮過程中，HA的溶出量最高。上述結(jié)果提示，在3種雙酯型生物堿中，HA在烏頭屬藥材的炮制和煎煮等加工過程中不易被破壞，含量相對最高。因此，在細(xì)胞水平觀察HA的毒性反應(yīng)，對于全面了解烏頭屬藥材的毒性作用，深入探討HA在烏頭屬藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。但目前尚無關(guān)于HA心肌細(xì)胞毒性的研究報(bào)道。本研究將在細(xì)胞水平觀察HA對原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞的毒性損傷作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和藥品

出生3 d內(nèi)的SD乳大鼠，雌雄兼用，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2002-0003。HA純度≥98%，購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):200404，用DMSO溶解，制成貯備液，使用時(shí)用DMEM/F12培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度。

1.2 試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基和錐蟲藍(lán)(trypan blue)，美國Sigma公司;DMSO、胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(collagenaseⅡ，CoⅡ)，美國 Amresco 公司;5-溴-2'-脫氧尿核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)，瑞士Roche公司產(chǎn)品，由北京拜爾迪生物公司分裝;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;小鼠抗大鼠α橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin)，兔抗大鼠纖連蛋白多克隆抗體和生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG抗體及即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純，北京化工廠。RCO-3000T-5V型CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國G.S.公司;DMIL HC倒置相差顯微鏡，德國Leica公司;ECLIPSE80i型正置熒光生物顯微鏡，日本Nikon公司;Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件，Media Cybernetics公司;UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 原代心肌細(xì)胞的制備與培養(yǎng)

按文獻(xiàn)［6］方法，進(jìn)行改良。無菌條件下取出乳大鼠心臟，在預(yù)冷D-Hank液中清洗3～4次。將心肌組織剪為1 mm3大小，加入3倍體積的消化酶(終濃度均為0.04%的胰酶和CoⅡ混合液，用前混勻)，于37℃，空氣浴下以每分鐘30～40次的速率振蕩10～20 min，反復(fù)至消化完全;除第一次外，收集各次消化后的上清液，加入等體積含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，于4℃，91.8 ×g 離心10 min，收集所有細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾去除未消化的組織塊。接種于25 cm2的卡式培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度孵箱中，差速貼壁法分離非心肌細(xì)胞;每次90 min，共2次。所得未貼壁細(xì)胞即心肌細(xì)胞，計(jì)數(shù)。按實(shí)驗(yàn)需要接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mmol·L－1的 BrdU 抑制成纖維細(xì)胞增殖，加雙抗(100 kU·L－1青霉素，100 kU·L－1鏈霉素)預(yù)防細(xì)菌污染，37℃，5%CO2，91%濕度環(huán)境中培養(yǎng)，36 ～48 h 換液1次，培養(yǎng)3～4 d后使用。

1.4 心肌細(xì)胞的鑒定

1.4.1 心肌細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 錐蟲藍(lán)染色法檢測心肌細(xì)胞存活率［7］

取細(xì)胞懸液 100 μl，加 100 μl 0.4% 錐蟲藍(lán)，無血清培養(yǎng)液或PBS 800 μl，在Eppendorf管內(nèi)充分混勻，3 min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板鏡下分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.3 心肌細(xì)胞的免疫化學(xué)鑒定

制備的細(xì)胞培養(yǎng)4 d后棄培養(yǎng)液，預(yù)冷(－20℃)甲醇和丙酮液(1∶1，V/V)固定過夜。將待測心肌細(xì)胞分為2組，在24孔培養(yǎng)板，分別滴加小鼠抗大鼠α橫紋肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體和兔抗大鼠纖連蛋白多克隆抗體，室溫孵育2 h后再分別滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG抗體，室溫孵育20 min，按試劑盒說明書繼續(xù)加入SABC復(fù)合物，DAB顯色，蒸餾水終止顯色反應(yīng)。蘇木素核復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。α橫紋肌肌動(dòng)蛋白僅存于心肌細(xì)胞和橫紋肌，不存在于平滑肌，α橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞即心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞上無纖連蛋白，纖連蛋白免疫反應(yīng)陰性，表明沒有其他細(xì)胞污染。

1.5 心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的測定［8］

心肌細(xì)胞接種于25 cm2卡式培養(yǎng)瓶中，每瓶4 ml，密度為1×109L－1。培養(yǎng)4 d后，給藥前30 min更換無血清的培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下記錄30 s內(nèi)細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)，計(jì)算波動(dòng)頻率。隨后分為培養(yǎng)基對照，HA 3，6，30，60 和120 μmol·L－1組，分別在給藥后5，15，30 和60 min用相同方法記錄細(xì)胞波動(dòng)頻率。每瓶隨機(jī)選取3個(gè)視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 心肌細(xì)胞形態(tài)觀察

心肌細(xì)胞接種于25 cm2卡式培養(yǎng)瓶中，每瓶4 ml，密度為1×109L－1。培養(yǎng)3 d后，給藥前12 h更換無血清的培養(yǎng)基。根據(jù)1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以HA體外導(dǎo)致心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率消失的終濃度為最高濃度，將細(xì)胞隨機(jī)分為 HA 30，60 和120 μmol·L－1組和培養(yǎng)基對照組，在倒置顯微鏡下分別觀察給藥后15，30，60和120 min心肌細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.7 心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率的測定

心肌細(xì)胞接種于48孔板，每孔500 μl，細(xì)胞密度1×109L－1。培養(yǎng)3 d后，給藥前12 h更換無血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組同1.6，并增設(shè)DMSO對照組。HA 30，60 和 120 μmol·L－1組加入含 HA 無血清培養(yǎng)基，分別孵育15，30和60 min，吸取培養(yǎng)基，4℃保存。在48孔板內(nèi)再加入無血清培養(yǎng)基500 μl，置于－20℃冷凍4 h后化凍。分別取等體積第一次獲得的培養(yǎng)基和凍融液，按試劑盒說明書測定LDH活性，計(jì)算LDH漏出率。LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液LDH活性/(培養(yǎng)液LDH活性+凍融液LDH活性)×100%

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 制備的心肌細(xì)胞質(zhì)量鑒定

在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的心肌細(xì)胞尚未貼壁，呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)36～48 h后，心肌細(xì)胞已全部貼壁生長，細(xì)胞核凸出明顯，貼壁后細(xì)胞為梭形、菱形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇，可出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)。心肌細(xì)胞平均存活率≥90%。經(jīng)免疫化學(xué)染色法分析，心肌細(xì)胞α橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫反應(yīng)陽性(圖1A)，纖連蛋白免疫反應(yīng)陰性(圖1B)。上述結(jié)果表明，制備的心肌細(xì)胞質(zhì)量滿意，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞鑒定(免疫組織化學(xué)法 ×400).A:抗α橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色，陽性;B:抗纖連蛋白免疫染色，陰性.Fig.1 Identification of primary cultured cardiac cells(Immunohistochemistry ×400).

2.2 次烏頭堿對心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的影響

心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)4 d后，自發(fā)搏動(dòng)頻率為40～50 min－1。心肌細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)60 min后，細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)頻率呈下降趨勢。HA 3 μmol·L－1作用5～30 min對心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率無明顯影響;作用60 min時(shí)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率與同一時(shí)間點(diǎn)的對照組比較明顯升高(P＜0.05)。HA 6和30 μmol·L－1使心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率加大，與給藥前比較，作用5～30 min時(shí)搏動(dòng)頻率快速增加(P＜0.01，P＜0.05)，類似抽搐狀態(tài)，與同一時(shí)間點(diǎn)的對照組比較，細(xì)胞搏動(dòng)頻率亦顯著增加(P＜0.01，P＜0.05);HA 60 μmol·L－1作用 5 min 與給藥前及同一時(shí)間的對照組比較;心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率加快(P＜0.05);15 min時(shí)恢復(fù)到對照組水平，30～60 min時(shí)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率明顯減慢，并有停搏現(xiàn)象。HA 120 μmol·L－1給藥后心肌細(xì)胞立即有停搏現(xiàn)象(表1)。

2.3 次烏頭堿對心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率的影響

表2結(jié)果顯示，與DMSO對照組比較，HA 30，60和120 μmol·L－1作用 15，30 和 60 min 后，LDH 漏出率增多(P＜0.01);表明心肌細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞受損，但未表現(xiàn)出完全的量-效與時(shí)-效關(guān)系。

2.4 次烏頭堿對心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖2可見，心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后全部貼壁生長，細(xì)胞核凸出明顯，貼壁后細(xì)胞為梭形、菱形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇，可出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)。將含有HA的無血清培養(yǎng)基與心肌細(xì)胞共同孵育，隨著HA濃度增加和作用時(shí)間延長，鏡下可見心肌細(xì)胞的胞體折光性下降，胞漿皺縮變小，偽足減少，突起縮短;細(xì)胞表面呈泡狀突起，形成類似“菜花狀”的大泡;胞漿內(nèi)黑褐色的沉著斑點(diǎn)增多，部分細(xì)胞脫壁死亡，特別是 HA 120 μmol·L－1作用 120 min 時(shí)鏡下可見折光性強(qiáng)的死亡細(xì)胞。

表1 次烏頭堿(HA)對原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的影響Tab.1 Effect of hypaconitine(HA)on spontaneous beating rate of primary cultured cardiac cells

表2 HA對原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)漏出率的影響Tab.2 Effect of HA on release rate of lactate dehydrogenase(LDH)of primary cultured cardiac cells

圖2 HA與心肌細(xì)胞作用15(A)和120 min(B)對細(xì)胞形態(tài)的影響 (×10).細(xì)胞處理見表1.1～4:HA 0，30，60和120 μmol·L－1.Fig.2 Effect of HA on modality of cardiac cells cultured for 15(A)and 120 min(B)(×10).

3 討論

本研究制備的乳大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)錐蟲藍(lán)拒染法鑒定心肌細(xì)胞存活率大于90%。心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后開始貼壁，鏡下呈梭形、菱形或多角形，伸出偽足，形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇，并有自發(fā)節(jié)律性搏動(dòng)。培養(yǎng)48 h后，用抗α橫紋肌肌動(dòng)蛋白和抗纖連蛋白多克隆抗體進(jìn)行免疫化學(xué)染色，心肌細(xì)胞α橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫染色陽性，纖連蛋白免疫反應(yīng)陰性。說明本研究制備的心肌細(xì)胞可用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

本研究結(jié)果表明，HA對心肌細(xì)胞具有毒性作用，損傷程度與HA的濃度和作用時(shí)間有一定關(guān)聯(lián)。HA 6 ～30 mmol·L－1，作用5 ～30 min 內(nèi)即引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率加快，并偶見搏動(dòng)頻率不齊現(xiàn)象;作用時(shí)間60 min后，心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率逐漸減弱，HA 30 mmol·L－1可同時(shí)引起細(xì)胞LDH漏出率增加;HA 60 mmol·L－1在作用5 min時(shí)引起心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率增加，隨著作用時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)中觀察到心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率恢復(fù)，并有搏動(dòng)減緩及停搏發(fā)生，LDH漏出率增加;HA 120 mmol·L－1給藥后立即導(dǎo)致心肌細(xì)胞停搏，并在較短的時(shí)間(5～30 min)內(nèi)使心肌細(xì)胞膜受損，LDH漏出率增加。HA 60 mmol·L－1作用120 min后，鏡下可見個(gè)別心肌細(xì)胞出現(xiàn)脫壁死亡現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示HA參與了心肌細(xì)胞的毒性損傷過程，在細(xì)胞水平，HA 30 ～120 mmol·L－1均能引起顯著的心肌細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率改變、LDH漏出率增加及細(xì)胞脫壁死亡等。本研究從細(xì)胞水平初步闡明HA對心肌細(xì)胞具有毒性作用。有關(guān)HA體內(nèi)給藥對動(dòng)物心功能的影響及HA心肌毒性的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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