吳艷平，何艷艷，齊秀蘭，徐 威，陳 羽，孫 璐

(沈陽藥科大學1.分析化學教研室，2.微生物學教研室，3.高等職業(yè)技術學院，遼寧沈陽 110016)

鹽酸安非他酮(1-(3-氯苯基)-2-［(1，1-甲基乙基)氨基］-1-丙酮鹽酸鹽)(amfepramone)屬氨基酮類抗抑郁藥，具有良好的治療作用和較小的不良反應，同時也是全球第一個非尼古丁類似物的戒煙藥［1］，該藥在人和動物體內(nèi)的代謝途徑主要包括叔丁基羥基化、苯環(huán)羥基化、羰基還原及進一步與葡萄糖醛酸或硫酸結合［2］。其中叔丁基羥基化安非他酮結構中的羥基會迅速與羰基成環(huán)，形成代謝產(chǎn)物2(metabolite 2，M2)，經(jīng)確認為嗎啉環(huán)羥基化安非他酮(morpholine-hydroxyamfepramone)，這一代謝反應在人體中較為少見，具有一定的研究價值。雖有文獻報道M2的合成工藝［3］，但操作復雜，副產(chǎn)物較多。小克銀漢霉菌屬中的一些菌株具有與哺乳動物細胞色素P450同工酶非常類似的代謝酶類，可以進行某些與哺乳動物相似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝反應［4－5］。本研究從小克銀漢霉菌屬真菌中篩選出4株最佳菌株，并在采用此菌株優(yōu)化最佳轉化條件的同時探討用其制備M2純品的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)、刺孢小克銀漢霉(C.echinulata AS 3.2004)、雅致小克銀漢霉(C.elegans AS 3.156)和雅致小克銀漢霉(C.elegans AS 3.2028)由沈陽藥科大學微生物學教研室提供。

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，成分為:蔗糖1.5 g，瓊脂2.0 g，馬鈴薯20 g 和蒸餾水100 ml。種子和轉化培養(yǎng)基:葡萄糖 2.0 g，酵母膏 0.5 g，蛋白胨0.5 g，氯化鈉 0.5 g，磷酸氫二鉀 0.5 g 和蒸餾水100 ml，pH調至 8.0。培養(yǎng)基均于 115℃ 滅菌30 min。

1.2 藥品和儀器

安非他酮由沈陽華泰藥物研究有限公司提供，純度＞99.8%。液相色譜-多級質譜分析所用試劑均為色譜純，其他試劑均為市售生物化學試劑和分析純試劑。

Agilent 1100 SL型液相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent公司，美國)，KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，LD5-2A低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)，DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱(上海申賢恒溫設備廠)，JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，HH-B 11-80S電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市實驗儀器廠)，MJ-250I霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，銀州牌280型手提式壓力蒸汽消毒器(遼寧省鐵嶺市醫(yī)療器械總廠)，TG 328B豪華型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)和Strata C18-E固相萃取柱(菲羅門公司，美國)。

1.3 孢子和種子的制備

將4℃保存的4個菌株分別接種于相應的斜面培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)7 d，得到菌絲生長旺盛、孢子豐富的培養(yǎng)物。用無菌接種環(huán)取一環(huán)含有大量孢子的菌絲體，僅將孢子接入種子瓶(250 ml三角瓶內(nèi)裝50 ml培養(yǎng)基)，于28℃振蕩培養(yǎng)24 h，得到種子培養(yǎng)物。

1.4 安非他酮的微生物轉化和轉化液的收集

以5%的量將4種種子培養(yǎng)物轉至轉化瓶(100 ml三角瓶內(nèi)裝20 ml培養(yǎng)基)，采用上述振蕩培養(yǎng)條件，預培養(yǎng)24 h后加入安非他酮無菌水溶液，使安非他酮終濃度達到0.1 g·L－1，轉化反應持續(xù)168 h。取轉化培養(yǎng)物上清液，置－20℃冷凍待測。另設3組分析對照樣品:對照1(轉化菌株+培養(yǎng)基)，排除轉化菌株的自身代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基殘留成分的干擾;對照2(安非他酮+培養(yǎng)基)，考察轉化液中是否存在非微生物引起的安非他酮分解產(chǎn)物，同時確定安非他酮在液相色譜分析時的出峰時間;對照3(純培養(yǎng)基)，消除培養(yǎng)基成分的影響。

1.5 分析樣品制備和液相色譜-質譜分析條件

將冷凍的安非他酮微生物轉化樣品及對照樣品在室溫下融化。用2 ml甲醇和2 ml水依次活化固相萃取小柱，然后取300 μl轉化液，與700 μl水混合后通過固相萃取小柱，用1 ml水洗滌，再用1 ml甲醇洗脫，將洗脫液在40℃氮氣流下吹干，100 μl流動相溶解，20 μl進樣進行液相色譜-多級質譜分析。

色譜柱為 Agilent Extend C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水-甲酸(35∶65∶0.2，V/V/V);流速為0.5 ml·min－1;室溫。質譜電噴霧離子化源(ESI)，正、負離子檢測方式。氮氣霧化氣壓力 30 psi，氮氣干燥氣流速 8.0 L·min－1，源電壓4.0 kV，毛細管溫度325℃，碰撞能量 1.0 V。

1.6 轉化菌株的篩選

采用液相色譜-質譜測定經(jīng)4種小克銀漢霉對安非他酮的轉化液中的安非他酮及其轉化產(chǎn)物，以總產(chǎn)率即菌株產(chǎn)生的所有轉化產(chǎn)物的峰面積占所有轉化產(chǎn)物與原形藥物峰面積之和的百分比來表示菌株的轉化能力。

1.7 安非他酮的微生物轉化條件優(yōu)化

通過菌株篩選實驗，確定采用短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物。為了進一步制備轉化產(chǎn)物M2，優(yōu)化短刺小克銀漢霉AS 3.153對安非他酮的轉化條件。

1.7.1 轉化條件的單因素考察實驗

底物終濃度分別為 0.025，0.05，0.1 和 0.2 g·L－1，轉化時間分別為72，96，120，144 和168 h，初始 pH 值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 和 8.5的單因素優(yōu)化實驗，確定最佳轉化條件及正交試驗的因素和水平。

1.7.2 轉化條件的進一步優(yōu)化

根據(jù)文獻［6］，培養(yǎng)基初始pH、底物濃度、轉化時間和微生物4個因素對安非他酮轉化率有影響。在單因素考察的基礎上，每個因素又各自選取了3個水平(表1)，忽略各因素間的相互作用，采用L9(34)正交試驗設計(表2)確定最佳轉化條件。

表1 安非他酮優(yōu)化轉化條件的4個因素及其3個水平Tab.1 Factors and levels of amfepramone transformation conditions

表2 安非他酮轉化條件考察的正交實驗設計Tab.2 Orthogonal expreiment of amfepramone transformation conditions

1.8 統(tǒng)計學分析

根據(jù)文獻和預實驗，各因素間的相互作用可以忽略。根據(jù)預實驗挑選的4因素和各因素的3水平，采用L9(34)正交試驗設計優(yōu)化最佳轉化條件。

2 結果

2.1 安非他酮代謝產(chǎn)物的高效液相-多級質譜分析

安非他酮的總離子流和選擇離子流色譜圖見圖1，安非他酮及其轉化產(chǎn)物M1，M2和M3的一級質譜圖見圖2，安非他酮及M1，M2和M3的二級和三級質譜圖見圖3。結果顯示，每個菌株的3組對照樣品對轉化產(chǎn)物和殘留底物的分析檢測均無干擾。在(+)ESI-MS一級全掃描質譜條件下，安非他酮主要生成質荷比(mass-to-charge ratio，m/z)為240(［M+H］+)(圖2A)的準分子離子。采用電噴霧離子阱質譜技術選擇性地對其進行二級質譜分析，安非他酮主要脫去叔丁基，生成m/z為184的碎片離子(圖3A)。

以安非他酮底物對照樣品(對照2)的總離子流色譜圖(total ion current，TIC)(正離子檢測)為對照(圖1A1)，在短刺小克銀漢霉菌轉化樣品的色譜圖中幾乎沒有檢測到安非他酮的原形藥物(m/z=240)，而是發(fā)現(xiàn)了2個準分子離子m/z為256(［M+H］+)的M1(圖2B)和M2(圖2C)(圖1B1)。根據(jù)藥物代謝的一般規(guī)律，轉化產(chǎn)物的準分子離子比母體藥物大16 u，可能為單羥基化代謝產(chǎn)物。對M1進行二級全掃描質譜分析，主要生成碎片離子m/z 200和m/z 182 u(圖3B)。其中碎片離子m/z 200比母離子小56 u，為脫去叔丁基后生成的碎片離子，質譜斷裂方式與母體藥物一致，且m/z 200比m/z 184大16 u，表明羥基化位點發(fā)生在安非他酮脫叔丁基后的剩余部分上;碎片離子m/z 182為M1脫叔丁基后進一步脫水生成。M1的質譜數(shù)據(jù)與文獻［7］一致，推測M1為苯環(huán)單羥基化安非他酮。在M2的二級全掃描質譜中，主要生成碎片離子m/z 238(圖3C)和m/z 184(響應值約為基峰m/z 238的1%)。其中碎片離子m/z 184與母體藥物脫去叔丁基后的碎片一致，推測羥基化位點發(fā)生在叔丁基上;碎片離子m/z 238為M2脫水生成。將M2進行分離純化，根據(jù)質譜數(shù)據(jù)并結合NMR方法(圖略)，確證代謝產(chǎn)物M2為嗎啉環(huán)羥基化安非他酮。

圖1 高效液相色譜-質譜總離子流(TIC)和選擇離子監(jiān)測(EIC)模式下安非他酮的底物的對照品(A)和經(jīng)短刺小克銀漢霉AS 3.153轉化的轉化樣品(B)的色譜圖.1.正離子檢測方式(+MS)，2.負離子檢測方式(－MS).Fig.1 Chromatograms of amfepramone substrate control sample(A)and transformed amfepramone sample from C.blakesleana AS 3.153(B)by total ion current(TIC)scan mode and selected ion monitoring(SIM)scan mode.

圖2 安非他酮(A)及其代謝產(chǎn)物M1(B)，M2(C)，M3(D)的一級質譜圖.+MS:正離子檢測方式;－MS:負離子檢測方式.Fig.2 Full scan MS of amfepramone(A)and its metabolites M1(B)，M2(C)and M3(D).

圖3 安非他酮(A)及其代謝產(chǎn)物M1(B)，M2(C)，M3(D)的二級質譜和M3的三級質譜.MS2:二級質譜.MS3:三級質譜.(+)正離子檢測方式;(－):負離子檢測方式.Fig.3Full scan MS2of amfepramone(A)，M1(B)，M2(C)，M3(D)and MS3of M3(E).

以安非他酮底物對照品(對照2)的TIC色譜圖(負離子檢測)為對照(圖1A2)，在短刺小克銀漢霉菌轉化樣品的色譜圖中還檢測到準分子離子m/z 334(［M－H］－)(圖2D)的代謝產(chǎn)物M3(圖1B2)。對其進行二級全掃描質譜分析，主要生成減少了80 u的碎片離子m/z 254(圖3D)，而 m/z 254為單羥基化安非他酮的負離子掃描結果，推測M3為單羥基化安非他酮的硫酸結合物。對m/z 254進行三級全掃描質譜分析，主要生成碎片離子m/z 154和m/z 182(圖3E)，其中m/z 154為m/z 254脫去叔丁胺基乙基后生成的碎片離子，m/z 182為脫去叔丁胺基后生成的碎片離子，推測羥基化位點發(fā)生在苯環(huán)上。而且M3的質譜斷裂方式與文獻［2］一致，可推測代謝產(chǎn)物M3為苯環(huán)單羥基化安非他酮的硫酸結合物。綜合以上結果，短刺小克銀漢霉AS 3.153對藥物安非他酮的代謝途徑見圖4。

2.2 安非他酮轉化菌株的篩選

短刺小克銀漢霉AS 3.153，刺孢小克銀漢霉AS 3.2004，雅致小克銀漢霉AS 3.156和雅致小克銀漢霉AS 3.2028 4種小克銀漢霉菌對安非他酮均具有一定的轉化能力，總產(chǎn)率分別為88.0%，78.3%，50.2%和42.7%。其中短刺小克銀漢霉AS 3.153的總轉化率最高，生成代謝產(chǎn)物M2的比例也最高，故將其作為安非他酮藥物代謝研究的體外模型作進一步研究。

2.3 短刺小克銀漢霉AS 3.153對安非他酮的轉化條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對安非他酮轉化的影響

微生物轉化的實質是進行酶促反應，pH值作為影響藥物代謝酶活性的因素同樣也影響轉化反應的進行程度。轉化體系中環(huán)境的pH在影響酶分子解離狀態(tài)的同時也影響了底物的解離狀態(tài)，通常分子狀態(tài)的底物更容易透過細胞膜進入菌體發(fā)生轉化;pH過高或過低均影響酶蛋白的構象，甚至使其喪失活性。培養(yǎng)基在初始 pH 值為 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5 時，總產(chǎn)率分別為 17.4%，60.7%，77.1%，81.5%，88.0%和 85.0%，其中 pH 8.0 時轉化率達到最大值88%。

2.3.2 底物濃度對安非他酮轉化的影響

安非他酮濃度對短刺小克銀漢霉AS 3.153轉化安非他酮的產(chǎn)率影響較大。安非他酮終濃度為0.025，0.05，0.1 和 0.2 g·L－1時的短刺小克銀漢霉對安非他酮的轉化產(chǎn)率分別為64.1%，67.5%，87.0%和 73.7%;其中當安非他酮濃度為 0.1 g·L－1時，代謝物M2產(chǎn)率達到最大值87%。

2.3.3 轉化時間對安非他酮轉化的影響

微生物轉化安非他酮的主要產(chǎn)物M2在不同時間的累積量差異較大。轉化時間為168 h時，安非他酮幾乎完全被轉化，M2的轉化率最大。

圖4 安非他酮在微生物中的化學轉化過程.M1，M2，M3和M4為安非他酮的代謝產(chǎn)物.M4為本實驗未直接檢測的代謝產(chǎn)物.Fig.4 Metabolic pathways of amfepramone in microorganism.

2.3.4 正交實驗對安非他酮的轉化條件的進一步優(yōu)化

忽略各因素間的相互作用，正交實驗設計結果如表3所示。從表中可以看出，培養(yǎng)基初始pH因素中為最大，即培養(yǎng)基初始pH因素中3水平的平均轉化率最高。同理來選擇底物濃度、轉化時間和微生物3因素的最優(yōu)水平，得安非他酮的最佳轉化條件為采用短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物，培養(yǎng)基初始 pH 8.5，底物濃度 0.1 g·L－1和轉化時間為168 h。

3 討論

自提出哺乳類動物藥物代謝的微生物模型概念以來，微生物轉化作為一種平行于人體藥物代謝的手段而發(fā)展起來，為現(xiàn)代藥理學與毒理學的藥物代謝研究提供了一些有用的方法。

在文獻［7］的基礎上，本實驗篩選了小克銀漢霉菌屬的4種菌株，確定以短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物。短刺小克銀漢霉AS 3.153主要將安非他酮轉化為苯環(huán)羥基化安非他酮(M1)、嗎啉環(huán)羥基化安非他酮(M2)和苯環(huán)羥基化安非他酮的硫酸結合物(M3)，總轉化率達到88%。本研究檢測到的代謝產(chǎn)物與文獻中報道的人體內(nèi)安非他酮代謝產(chǎn)物結構相同，可認為該菌株是研究安非他酮代謝反應的適宜體外模型。但安非他酮在人體內(nèi)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物除了硫酸結合物外，還有葡萄糖醛酸結合物。而在微生物模型中只找到硫酸結合物，說明微生物轉化和哺乳動物代謝之間仍存在著一定的種屬差異，造成這種差異的原因可能是用于安非他酮代謝研究的短刺小克銀漢霉AS 3.153體內(nèi)缺少與葡萄糖醛酸結合反應相關的代謝酶或輔助因子。

表3 正交實驗設計的安非他酮轉化條件Tab.3 Results of orthogonal experiment of amfepramone transformation conditions

為了制備代謝產(chǎn)物M2，本實驗采用單因素考察實驗和正交實驗兩種方法來確定安非他酮微生物轉化的最佳條件。實驗結果表明，除培養(yǎng)基的初始pH有微小差別外，其他最佳條件均一致。

與哺乳動物生物轉化相比，微生物轉化具有很強的專一性，能夠用來進行特定的藥物代謝反應［8］，此外，微生物轉化法還具有周期短、成本低［9］、易調節(jié)和易放大等特點［10－11］。本研究篩選出的短刺小克銀漢霉AS 3.153可以作為研究人用藥物代謝的體外模型，同時，還可以采用優(yōu)化后的轉化條件制備M2純品。

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