李群力，陳 菲，麻佳蕾，汪 妍

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室，浙江金華 321007)

目前，臨床治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有各種鈣制劑、氟化物、維生素D類藥物、二膦酸鹽、雌激素和利尿藥等，長期服用具有誘發(fā)腫瘤和惡心嘔吐等不良反應(yīng)。因此，尋找安全有效的治療藥物具有重要的社會意義與經(jīng)濟(jì)價值。乙二胺四亞甲基膦酸鹽 (ethylenediamine tetramethylene phosphonate，EDTMP)是一種新型胺基大分子有機(jī)膦酸鹽，對骨組織有很強(qiáng)的親和力，能很快積聚在骨折以及骨小梁和皮質(zhì)骨受破壞區(qū)域，有效抑制骨代謝失衡，從而增加骨形成;有效緩解骨交換中激化因子對痛覺神經(jīng)的刺激作用，達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的。含有EDTMP的體內(nèi)放射新藥［153Sm］EDTMP于1997年上市，iv給藥可緩解癌癥骨轉(zhuǎn)移疼痛，其在體內(nèi)僅被骨組織大量吸收，在其他臟器及軟組織中幾乎不存留，且在體內(nèi)不降解，以原型排出［1－3］。在常用的治療骨質(zhì)疏松的藥物中，與EDTMP有相關(guān)性的藥物是二膦酸制劑。EDTMP作為一個有機(jī)膦酸，與二膦酸類分子的生化作用以及對骨疾病的治療有一定的相似性。但EDTMP與二膦酸鹽不是同一個分子，與二膦酸鹽有以下區(qū)別:①分子量大，不良反應(yīng)小，臨床使用可以靜脈推注，而二膦酸鹽只能緩慢點滴;②與體內(nèi)血漿蛋白等分子不結(jié)合，沒有進(jìn)入骨細(xì)胞的藥物分子幾乎是全部以藥物原型從尿中排出，二膦酸分子有一部分與蛋白結(jié)合;③對于破骨細(xì)胞活性的抑制可能是通過對成骨細(xì)胞干擾來完成的，而不是直接作用于破骨細(xì)胞;④能抑制局部區(qū)域?qū)е略錾猿晒羌?xì)胞的過度活性;⑤與二膦酸相比，對金屬具有較強(qiáng)的絡(luò)合能力，可以直接將鈣離子螯合，帶到鈣流失較大的病灶部位。但EDTMP是一個很強(qiáng)的絡(luò)合配體，進(jìn)入動物體內(nèi)能迅速與血液中的鈣、鎂離子螯合，造成鈣、鎂離子水平急劇下降，使機(jī)體無法維持正常的血管緊張程度和心臟正常的起搏功能。Ca-EDTMP是將鈣離子與EDTMP螯合，使藥物螯合性大大降低，從而使毒性明顯低于不含鈣的EDTMP。目前關(guān)于 EDTMP，國內(nèi)尚無相關(guān)研究報道，國外有一項專利申請［4］。本研究采用切除卵巢方法建立大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，研究Ca-EDTMP預(yù)防性給藥治療骨質(zhì)疏松癥的效果，以期為開發(fā)療效確切、不良反應(yīng)較少的防治骨質(zhì)疏松的新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

EDTMP凍干粉針，每支70 mg，Ca-EDTMP含量92.5%，由金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院自制;陽性對照藥氯膦酸二鈉(clodronate disodium)，廣州明興制藥廠生產(chǎn)，批號070703;戊巴比妥鈉，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器

Hologic骨密度測定儀(美國Hologic公司);鈣試劑盒(衛(wèi)生部上海生物制品研究所)，磷試劑盒(上海捷門生物技術(shù)公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所);馬弗爐(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠);Autograph Shimadzu生物力學(xué)測定儀(日本島津);722S分光光度計(上海科學(xué)精密儀器有限公司)。

1.3 Ca-EDTMP的制備與結(jié)構(gòu)確證

Ca-EDTMP的制備是將亞膦酸、鹽酸和乙二胺鹽酸鹽加熱回流，滴加甲醛溶液，10 h后析晶，干燥得EDTMP粗品，以濃氨水溶解粗品，加鹽酸回流，析晶，干燥得EDTMP精品。EDTMP精制品以水為溶媒，攪拌下逐漸加入Ca(OH)2，直至溶液澄清，濾過，凍干，即得Ca-EDTMP凍干粉針。對Ca-EDTMP的結(jié)構(gòu)確證研究采用元素分析、紅外、核磁共振、質(zhì)譜和紫外等方法，著重研究Ca-EDTMP的化學(xué)結(jié)構(gòu);總鈣量的測定以《中國藥典》2005版二部附錄ⅣD原子吸收分光光度法第二法(標(biāo)準(zhǔn)加入法)規(guī)定的方法，以基準(zhǔn)碳酸鈣溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液(6.25 mg·L－1)，鈣空心陰極燈為光源，在422.7 nm依法測定;采用紫外分光光度法測定酸性、堿性條件下Ca-EDTMP溶液中游離鈣離子的濃度，確證EDTMP與鈣在不同pH條件下的絡(luò)合穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，當(dāng)溶液在pH 7.5～8.5時，EDTMP能與鈣形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，檢測不到游離的鈣。鈣總量以基準(zhǔn)碳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液計算標(biāo)示量為99.6%，按照Ca-EDTMP干燥品計為5.0%。且能確證Ca-EDTMP的結(jié)構(gòu)。

1.4 動物、模型的制備及分組

SD大鼠，♀，體重190～210 g;中科院上海實驗動物中心提供，合格證:中科動管委第005號。

80只隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、模型對照組、Ca-EDTMP 2，4，8，16，32 mg·kg－1組和氯膦酸二鈉組，每組10只。大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉，常規(guī)消毒。除假手術(shù)組打開腹腔后縫合外，其他各組大鼠在無菌條件下雙側(cè)去除卵巢，將輸卵管結(jié)扎。手術(shù)后第4天開始給藥，Ca-EDTMP iv給予，每4周1次，共4次，每4周稱取體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。根據(jù)氯膦酸二鈉的臨床應(yīng)用劑量，成人(以60 kg 計)3.2 g·d－1，選定氯屈膦酸二鈉 50 mg·kg－1，每日 po，連續(xù) 120 d。末次給藥后 1 周處死動物，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.5 血清Ca、P水平和堿性磷酸酶活性的檢測

收集全血分離血清，－20℃保存，按照試劑盒說明測定血清中Ca，P水平和ALP活性。Ca的含量用甲基麝香草酚藍(lán)法測定，P的含量用紫外法測定，ALP的活性用2-氨基-2-甲基-1-丙醇法測定。

1.6 大鼠骨骨密度的測定

取大鼠右側(cè)股骨置于有機(jī)玻璃板上用Hologic骨密度測定儀測定股骨密度。

1.7 骨組織中Ca和P含量的測定

取大鼠左側(cè)股骨，稱重后于110℃烘干1 h，再置于馬弗爐內(nèi)200，400，600和800℃各灰化2 h?；一Y(jié)束，冷卻稱重，用 HCl 6 mol·L－1溶解，采用1.5中的方法測定骨組織中Ca和P含量。

1.8 生物力學(xué)指標(biāo)的測定

將大鼠右股骨置于Shimadzu生物力學(xué)測定儀上進(jìn)行股骨三點彎曲實驗加載速度5 mm·min－1，跨距10 min。記錄彈性模量(kg·mm－3)，最大載荷(N)，最大撓度(mm)，彈性壓力(kg·mm－3)和彈性應(yīng)變(%)數(shù)值。

1.9 病理學(xué)檢查

大鼠股骨骨頭用3%硝酸脫鈣作石蠟切片，HE染色，病理檢查股骨骨小梁的變化。

1.10實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中t檢驗進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠血清Ca，P水平和ALP活性的影響

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Ca水平變化不大，但血清P水平明顯增加(P＜0.05)，ALP 活性明顯增加(P ＜0.05)。與模型組比較，Ca-EDTMP組血清Ca在正常范圍內(nèi)波動，而血清 P水平明顯下降(P ＜0.05，P ＜0.01)，ALP 活性明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。氯膦酸二鈉也可降低血清P水平和 ALP活性(P＜0.01)，其影響與Ca-EDTMP基本一致。

表1 乙二胺四亞甲基膦酸鈣(Ca-EDTMP)對卵巢切除大鼠血清Ca，P水平及堿性磷酸酶(ALP)活性的影響Tab.1 Effect of calcium ethylenediamine tetramethylene phosphonate(Ca-EDTMP)on Ca and P contents and alkaline phosphatase(ALP)activity in ovariectomized rats

2.2 Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨骨密度和骨組織中Ca及P含量的影響

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨骨密度降低(P＜0.05);骨組織中Ca及P的含量也降低(P＜0.01)。與模型組比較，Ca-EDTMP 2和4 mg·kg－1組能提高卵巢切除大鼠股骨骨密度，但無統(tǒng)計學(xué)差異;Ca-EDTMP 8，16 和32 mg·kg－1明顯提高卵巢切除大鼠股骨骨密度(P ＜0.05，P ＜0.01)，并有一定的量效關(guān)系相關(guān)系數(shù)為0.965;除 Ca-EDTMP 2 mg·kg－1組無明顯影響外，其他 Ca-EDTMP 組骨組織中Ca及P的含量均明顯增加，且呈劑量相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.972，P ＜0.05，P ＜0.01)。氯膦酸二鈉也能明顯提高大鼠股骨骨密度(P＜0.01)，并明顯增加骨組織Ca及P的含量(P＜0.01)。

2.3Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的影響

表3結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、最大撓度、彈性應(yīng)力和彈性應(yīng)變均明顯降低，其中最大載荷下降32.3%(P＜0.01)，彈性應(yīng)變下降22.1%。與模型組比較，Ca-EDTMP各組最大載荷分別增加了23.9%，27.2%，28.7%，45.7% 和37.2%(P ＜0.01)，氯膦酸二鈉組最大載荷增加了33.4%(P＜0.01);Ca-EDTMP 8，16 和 32 mg·kg－1組彈性變化分別增加了44.8%，9.2%和45.2%(P ＜0.05)。

表2Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨骨密度(BMD)和骨組織中Ca及P含量的影響Tab.2 Effect of Ca-EDTMP on femur bone mineral density(BMD)and contents of Ca and P in ovariectomized rats

表3 Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的影響Tab.3 Effect of Ca-EDTMP on biomechanic properties of femur in ovariectomized rats

2.4Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨頭骨小梁的影響

圖1結(jié)果顯示，假手術(shù)組(圖1A)骨膜清晰，骨密質(zhì)細(xì)胞層次豐富，厚度正常，骨松質(zhì)區(qū)域見骨小梁豐富，小梁間見較豐富的骨髓組織。模型組(圖1B)見骨密質(zhì)較薄，細(xì)胞含量少，骨小梁細(xì)長，小梁間空隙明顯增大，少見骨髓成分。Ca-EDTMP 8 mg·kg－1組(圖 1C)骨密質(zhì)厚度尚正常，可見少量腔隙生成，骨松質(zhì)中骨小梁細(xì)長，排列較松散，骨髓含量較少。Ca-EDTMP 16 mg·kg－1組(圖1D)骨密質(zhì)厚度正常，骨松質(zhì)中小梁較稀疏，骨髓含量不豐富。Ca-EDTMP 32 mg·kg－1組(圖1E)骨密質(zhì)厚度正常，細(xì)胞層次較清晰，骨小梁增寬，相互聯(lián)結(jié)，骨髓較豐富。陽性氯膦酸二鈉組(圖1F)骨密質(zhì)形態(tài)正常，骨松質(zhì)所含比例正常，骨小梁寬，小梁間骨髓組織豐富。

3 討論

本研究陽性對照藥選用氯膦酸二鈉，未采用目前治療骨質(zhì)疏松癥的骨治療劑阿侖膦酸鈉(二膦酸鹽)，是考慮到阿侖膦酸鈉口服吸收較低，胃腸道反應(yīng)大，其服用方法和時間嚴(yán)格規(guī)定為:每天早上第一次進(jìn)食或給予其他藥物治療之前至少30 min，白開水送服，不能臥位服藥，服藥后需避免躺臥并保持活動至少30 min，以確保藥片進(jìn)入胃內(nèi)。在作為對照藥應(yīng)用時，其效果和應(yīng)用的方便性反而不及氯膦酸二鈉。

圖1 Ca-EDTMP對卵巢切除大鼠股骨頭骨小梁結(jié)構(gòu)的影響 (HE ×115).分組處理見表1.A:假手術(shù)組;B:模型組;C:Ca-EDTMP 8 mg·kg－1組;D:Ca-EDTMP 16 mg·kg－1組;E:Ca-EDTMP 32 mg·kg－1組;F:氯膦酸二鈉 50 mg·kg－1組.Fig.1 Effect of Ca-EDTMP on trabecula structure of femur in ovariectomized rats(HE ×115).

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，切除雙側(cè)卵巢后，大鼠股骨密度降低，血清P水平和ALP活性明顯增加，骨組織中Ca及P的含量也較低，彈性模量、最大載荷、最大撓度、彈性應(yīng)力和彈性應(yīng)變均明顯下降。股骨頭骨密質(zhì)較薄，細(xì)胞含量少，骨小梁細(xì)長，小梁間空隙明顯增大，少見骨髓成分，說明模型成立，其他文獻(xiàn)也有相同報道［5－6］。

評價骨質(zhì)疏松癥療效的主要指標(biāo)是骨密度的上升。本實驗結(jié)果顯示，給予Ca-EDTMP治療后，明顯提高卵巢切除大鼠股骨骨密度，并有一定的量效關(guān)系。

防治骨質(zhì)疏松癥的主要目的之一是防治骨折的發(fā)生，因此，骨的生物力學(xué)指標(biāo)是評價藥物療效的又一重要指標(biāo)［7］。本實驗中切除卵巢后大鼠股骨彈性模量、最大載荷、最大撓度、彈性應(yīng)力和彈性應(yīng)變均明顯降低，給予Ca-EDTMP治療后以上生物力學(xué)指標(biāo)均有提高，尤其是最大載荷和彈性應(yīng)變明顯增加。

生化指標(biāo)的變化反映體內(nèi)骨代謝平衡的變化，可用來評價骨轉(zhuǎn)換率，客觀地反映骨吸收和骨形成情況［8］。切除卵巢后大鼠血清中 Ca水平變化不大，P水平上升，ALP活性增加。給藥后可以降低血清P水平和ALP活性，表明Ca-EDTMP可有效抑制卵巢切除大鼠的骨量丟失。

正常骨小梁骨膜清晰，骨密質(zhì)細(xì)胞層次豐富，厚度正常，模型組大鼠骨小梁骨密質(zhì)較薄，細(xì)胞含量少，骨小梁細(xì)長。給予Ca-EDTMP治療后，隨劑量增加大鼠骨密質(zhì)厚度增加，細(xì)胞層次清晰，骨小梁增寬，相互聯(lián)結(jié)，骨髓較豐富。顯示Ca-EDTMP對改善大鼠骨松質(zhì)中骨小梁形態(tài)有明顯作用，Ca-EDTMP 32 mg·kg－1組與假手術(shù)組骨質(zhì)基本一致。

本研究結(jié)果顯示，在卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松癥模型中，Ca-EDTMP能增加股骨骨密度，增加股骨Ca及P含量，降低血清中P水平及ALP活性，使股骨的最大載荷、最大撓度、彈性應(yīng)變增強(qiáng)，表明其在防治骨質(zhì)疏松癥上有防止骨量的丟失，抑制骨吸收的作用，且呈劑量相關(guān)性。

本研究是手術(shù)后第4天給藥，屬于預(yù)防性給藥，因而對于骨質(zhì)疏松癥的臨床治療效果還有待于延長給藥時間進(jìn)一步來驗證。

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