吳枝娟，翁繩美，王瑞幸，方秋娟，黃自強(qiáng)

(福建醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，2.藥學(xué)院藥理學(xué)系，福建福州 350004)

13-甲基肉豆蔻酸(13-methyltetradecanoic acid，13-MTD)是一種末端支鏈飽和脂肪酸，能特異性地殺傷多種腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，線粒體及其相關(guān)凋亡分子是其重要作用位點(diǎn)［1－5］。二氨基肉豆蔻酸(biaminotetradecanoic acid，D-82)是13-MTD的新型衍生物。D-82在體內(nèi)外具有廣泛的抗腫瘤作用，體外抗腫瘤作用明顯強(qiáng)于13-MTD，體內(nèi)抗腫瘤作用與之相當(dāng)［6］。D-82抗腫瘤作用的機(jī)制尚不明確。以HL-60細(xì)胞為模型，從線粒體凋亡途徑活化的角度探討D-82誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

D-82由福建楊振華851生物科技股份有限公司提供，純度＞95%，0.8%吐溫80溶液助溶，配成1.2%溶液(W/V)，用無(wú)水乙醇稀釋成6 g·L－1儲(chǔ)備液，－70℃保存。臨用時(shí)，以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，乙醇終濃度不超過(guò)1%，吐溫80終濃度不超過(guò)0.1%。

RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司;小牛血清購(gòu)自Hyclone公司;羅丹明123(rhodamine 123)、吖啶橙(acridine orange，AO)及溴乙錠(ethidium bromide，EB)均購(gòu)自Sigma公司;蛋白酶K及RNA酶均購(gòu)自 Amerdsco公司。DNA Mark(Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ)購(gòu)自MBI Fermentas公司。胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9比色試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D System公司。考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。兔抗bcl-2，bax，細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt c)和β肌動(dòng)蛋白一抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。硝酸纖維素膜購(gòu)自美國(guó)Amersham公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司

1.2 儀器

BB5060型二氧化碳培養(yǎng)箱為上海賀利氏產(chǎn)品;Mod 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Gel Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品;熒光倒置顯微鏡為日本歐林巴斯公司產(chǎn)品;FASCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，于含10%小牛血清、100 kU·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞處理分為正常對(duì)照組、D-82 1.5，3 和6 mg·L－1處理 HL-60 細(xì)胞6 h 組。

1.4 錐蟲(chóng)藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞以5×107L－1密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入D-82 0(正常對(duì)照)，1.5，3.0，4.5 和 6.0 mg·L－1，各組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱共培養(yǎng)6 h。每孔加 0.4%錐蟲(chóng)藍(lán) 100 μl，染色5 min，計(jì)數(shù)各組錐蟲(chóng)藍(lán)拒染活細(xì)胞數(shù)。同樣方法，加入 D-82 6 mg·L－1，培養(yǎng) 6，12 和24 h 后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/正常對(duì)照組活細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 AO/EB染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

分別收集1.3處理后的各組細(xì)胞1×106，加入4 μl AO/EB染液混勻，滴于載玻片上，封片后在熒光顯微鏡觀察。分類計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳分析細(xì)胞DNA損傷

分別收集1.3處理后的各組細(xì)胞1×106，加50 μl細(xì)胞裂解液和 0.5 g·L－1蛋白酶 K，50℃ 溫育4 h，RNA酶37℃消化2 h，離心取上清。15 μl樣品與2.5 μl上樣緩沖液混和，上樣于以 0.5 ×TBE 緩沖液配制的1.5%瓊脂糖凝膠樣品槽，150 V電泳1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位

收集1.3處理后的細(xì)胞1×106，羅丹明123 0.5 mg·L－1避光染色30 min，PBS 洗滌2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)534 nm)，以平均熒光強(qiáng)度表示線粒體膜電位。

1.8 比色法檢測(cè)胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9酶活性

分別收集1.3處理后的各組細(xì)胞2×106，加細(xì)胞裂解液4℃裂解10 min，離心取上清用于測(cè)定胱天蛋白酶活性。考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白，取等量蛋白進(jìn)行測(cè)定。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定各樣品在波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值(A405nm)表示胱天蛋白酶活性。

1.9 Western印跡檢測(cè)胞漿及線粒體中細(xì)胞色素c和細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)

收集1.3處理后的細(xì)胞，PBS洗滌，加入單去污裂解緩沖液，4℃裂解30 min，離心取上清，即細(xì)胞總蛋白，用于測(cè)定Bcl-2和Bax含量。按文獻(xiàn)［7］的方法，分別提取胞漿部分及線粒體部分蛋白，用于測(cè)定Cyt c含量。考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白，各組取等量蛋白上樣SDS-PAGE凝膠。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過(guò)夜，一抗、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。檢測(cè)各蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)，同時(shí)以 β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量用目標(biāo)蛋白的IA與β肌動(dòng)蛋白的IA比值表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響

圖1A結(jié)果顯示，D-82抑制HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)，藥物濃度與HL-60細(xì)胞存活率密切相關(guān)，隨著藥物濃度的增加，HL-60細(xì)胞的存活率逐漸降低:D-82 1.5，3 和 6 mg·L－1處理 6 h，細(xì)胞存活率分別為(81 ±11)%，(70 ±9)%和(56±11)%。圖1B顯示D-82的作用時(shí)間與存活率的關(guān)系，D-82 6 mg·L－1作用12和 24 h后，HL-60細(xì)胞的存活率降至(36±7)%和(24±9)%。上述結(jié)果表明D-82對(duì)HL-60細(xì)胞存活有明顯的抑制作用，且對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.938(P ＜0.01)和0.809(P ＜0.05)。

圖1 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響.A:不同濃度D-82作用6 h HL-60存活率;B:D-82 6 mg·L－1作用不同時(shí)間HL-60的存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/正常對(duì)照組活細(xì)胞數(shù))×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.1 Effects of D-82 on HL-60 cell survival.

2.2 D-82對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

AO/EB染色熒光顯微鏡(圖2)顯示，正常對(duì)照組HL-60細(xì)胞呈綠色熒光，罕見(jiàn)凋亡細(xì)胞，凋亡率(2 ±2)%;D-82 1.5 mg·L－1作用 6 h，可見(jiàn)早期凋亡細(xì)胞散在分布，凋亡率(18±4)%;D-82 3 mg·L－1處理6 h，出現(xiàn)晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞，仍以早期凋亡細(xì)胞為主，凋亡率(40±11)%;D-82 6 mg·L－1處理6 h，出現(xiàn)大量壞死細(xì)胞，同時(shí)可見(jiàn)早期及晚期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞居多，凋亡率(75±11)%。藥物處理組凋亡率與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P＜0.05)。

圖2 D-82對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 (AO/EB ×400).A:正常對(duì)照;B ～D:分別為D-82 1.5，3和6 mg·L－1處理6 h組。白色箭頭示早期凋亡細(xì)胞;紅色箭頭示晚期凋亡細(xì)胞;藍(lán)色箭頭示壞死細(xì)胞.Fig.2 Effect of D-82 on HL-60 apoptosis(AO/EB ×400).

2.3 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞DNA損傷的影響

如圖3所示，正常對(duì)照組僅見(jiàn)一分子量很大的亮帶，是未裂解的 DNA 條帶;D-82 1.5 mg·L－1組，出現(xiàn)長(zhǎng)的“拖帶”;D-82 3及6 mg·L－1D-82處理組可見(jiàn)典型“階梯狀”條帶，呈180～200 bp整數(shù)倍遞增分布，提示DNA在核小體部位被切斷，細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞DNA損傷的影響.M:標(biāo)志;條帶1 ～3:分別為 D-82 1.5，3 和6 mg·L－1處理6 h 組;條帶4:正常對(duì)照.Fig.3 Effect of D-82 on HL-60 cells DNA fragmentation.

2.4 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

正常對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度為24±5;D-82 1.5 mg·L－1處理6 h平均熒光強(qiáng)度為23±6，與正常對(duì)照組比較差異不顯著;D-82 3及6 mg·L－1處理后，熒光強(qiáng)度顯著下降分別為20±5及12±4(n=3，P＜0.05)(圖4)。提示D-82能引起HL-60細(xì)胞線粒體跨膜電位下降。

圖4 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響.A:正常對(duì)照組;B ～D:分別為 D-82 1.5，3 和6 mg·L－1處理6 h組.Fig.4 Effect of D-82on mitochondrial membrane potential.

2.5 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性影響

與正常對(duì)照組比較，D-82 1.5 mg·L－1處理 HL-60細(xì)胞6 h對(duì)胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性影響不大;D-82 3 mg·L－1處理后，胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性增加了39%和61%，D-82 6 mg·L－1組胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性增加了125%和145%(表 1)。

表1 D-82對(duì)HL-60細(xì)胞胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性的影響Tab.1 Effects of D-82 on caspase 3 and caspase 9 activity in HL-60 cells

2.6 D-82對(duì)胞漿和線粒體中Cyt c及細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白含量的影響

圖5和表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，D-82 1.5 mg·L－1可下調(diào)細(xì)胞 Bcl-2 蛋白表達(dá)(P ＜0.05);D-82 3 和6 mg·L－1組，線粒體 Cyt c和細(xì)胞 Bcl-2 蛋白含量顯著降低，Bax含量明顯升高(P＜0.01);D-82 3和6 mg·L－1組，胞漿中 Cyt c 明顯增高(P＜0.05)，提示 D-82誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞線粒體 Cyt c外漏，同時(shí)減少細(xì)胞Bcl-2蛋白含量，增加Bax蛋白表達(dá)。

3 討論

圖5 Western印跡法檢測(cè)D-82對(duì)胞漿及線粒體細(xì)胞色素c(Cyt c)中細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白含量的影響.條帶1:正常對(duì)照;條帶2 ～4:分別為 D-82 1.5，3 和6 mg·L－1處理6 h組.Fig.5 Effect of D-82 on cytoplasmic and mitochondrial cytochrosome c(Cyt c)，Bcl-2 and Bax protein expression of HL-60 cells by Western blotting.

本研究首先考察D-82對(duì)HL-60細(xì)胞存活的影響及誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)果顯示，D-82作用濃度和時(shí)間與HL-60細(xì)胞存活率明顯相關(guān)。此外HL-60細(xì)胞經(jīng)D-82處理后，出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮、邊緣化和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，結(jié)合DNA電泳呈特征性“梯狀”電泳圖譜，表明D-82能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并有隨藥物濃度的增大而增加的趨勢(shì)。

D-82可使HL-60細(xì)胞線粒體跨膜電位降低，Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，D-82處理后HL-60細(xì)胞線粒體Cyt c含量減少，胞漿中Cyt c增多，說(shuō)明Cyt c線粒體釋放到胞漿，并伴隨胱天蛋白9與胱天蛋白3的活化。綜合以上結(jié)果提示，D-82誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的可能途徑之一是胱天蛋白依賴的線粒體途徑。D-82通過(guò)某種機(jī)制導(dǎo)致線粒體膜PTP孔道開(kāi)放或線粒體膜損傷導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低，使Cyt c從線粒體釋放，依次激活胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶等，募集下游眾多的胱天蛋白類，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8－10］。

本研究結(jié)果顯示，D-82在活化胱天蛋白依賴的線粒體凋亡途徑的同時(shí)，下調(diào)HL-60細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2含量，增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)，使Bax/Bcl-2值增大。

表2 D-82對(duì)胞漿及線粒體細(xì)胞色素c(Cyt c)，Bcl-2和Bax蛋白含量的影響Tab.2 Effect of D-82 on cytochrosome c(Cyt c)，Bcl-2 and Bax protein expression in mitochondrial of HL-60 cells

有研究表明，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，形成同源二聚體而活化，觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道開(kāi)放，誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，促使線粒體大量釋放Cyt c，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。而典型的抗凋亡蛋白Bcl-2過(guò)表達(dá)，則可與Bax形異源二聚體，引起Apaf-1變構(gòu)，抑制Cyt c釋放和胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3活化，阻斷線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［12－15］。細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2值升高，使線粒體膜通透性改變，孔道開(kāi)放，線粒體膜電位降低，Cyt c釋放，同時(shí)激活胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活化級(jí)聯(lián)，增進(jìn)胱天蛋白依賴的線粒體途徑的活化［16－18］。

本研究結(jié)果表明，D-82可通過(guò)升高HL-60細(xì)胞Bax/Bcl-2值，降低線粒體膜電位，誘發(fā)線粒體Cyt c釋放，激活胱天蛋白9和胱天蛋白3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化調(diào)控胱天蛋白依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，為D-82抗腫瘤應(yīng)用和脂肪酸類抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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