楊武雙,滕伯剛,楊立朝,周 宇,王 瑤,金 鑫

(1.廈門市中醫(yī)院 神經(jīng)外科,福建 廈門 361009;2.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系,福建 廈門 361005)

前胡甲素(dl-praeruptorin A,Pd-Ia)是傘形科植物白花前胡根中提出的一種角型吡喃香豆精(angular,typepyranocoumarin)[1]。Pd-Ia作為一種鈣阻滯劑和鉀通道開放劑,對心肌缺血具有保護(hù)作用[2-3]。常天輝等[3-4]給心肌急性缺血再灌注(MIR)大鼠同時(shí)靜脈注射Pd-Ia,能抑制血清IL-6水平,降低心肌凋亡刺激蛋白Fas、提高bcl-2/bax的比率,作用與硝苯地平接近。姜明燕等[5]對MIR大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行觀察,靜脈注射白花前胡及Pd-Ia的MIR大鼠心肌纖維排列較為整齊,線粒體豐富,雖見輕度腫脹,但包膜完整,形態(tài)規(guī)則,染色質(zhì)較均勻,亦提示其對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。涂欣等[6]采用大鼠局灶性腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型,給予白花前胡水醇提取物后,可明顯降低模型大鼠血清中的IL-6、IL-8水平。董夢久等[7]發(fā)現(xiàn)白花前胡提取物能明顯抑制MCAO大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá),提示前胡提取液對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

由于前胡提取液對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,其主要成分Pd-Ia對心肌缺血的保護(hù)作用也已被證實(shí),而心肌缺血與腦缺血的治療機(jī)制又有相同之處。目前未見Pd-Ia對腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)建立小鼠腦缺血模型,探討Pd-Ia對腦缺血損傷的保護(hù)作用及特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康昆明種小鼠,♂,體重25～30 g,由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號:SYXK(閩)2008-0003。自然光照周期飼養(yǎng),術(shù)前12 h禁食,自由飲水。

1.1.2 藥品及試劑 Pd-Ia(批號:090305,純度＞98%),上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品,臨用前用含10%二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水配置;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC),美國Amresco公司產(chǎn)品;丙二醛(MAD)測試試劑盒(批號:20081120)、超氧化物歧化酶(SOD)測試試劑盒(批號:20081120)均購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為市售分析純。

1.1.3 儀器 SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀,美國分子儀器公司;DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血/再灌注模型制備 參照Longa等[8]建立的方法制備小鼠右側(cè)大腦MCAO模型。小鼠用10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上。頸部正中切口,鈍性分離頸總動(dòng)脈,將頭端用聚胺酯處理的直徑為0.108 mm的尼龍絲線經(jīng)頸總動(dòng)脈切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈,微遇阻力時(shí)即停止,線栓插入總長度自頸總動(dòng)脈分叉部記為(1.6±0.1)cm。缺血1.5 h后拔除線栓,即恢復(fù)血供。動(dòng)物術(shù)中及術(shù)后麻醉清醒前給予保溫。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)對側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型制備成功。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組:①假手術(shù)組:術(shù)前0.5 h腹腔注射溶媒(10%DMSO)10 mL/kg;②模型組:術(shù)前0.5 h腹腔注射溶媒(10%DMSO)10 mL/kg;③、④、⑤分別為Pd-Ia高、中、低劑量組,即缺血前0.5 h分別腹腔給予Pd-Ia 10,5,1 mg/kg。

另取實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組:①假手術(shù)組:術(shù)前0.5 h腹腔注射溶媒(10%DMSO)10 mL/kg;②模型組:術(shù)前0.5 h腹腔注射溶媒(10%DMSO)10 mL/kg;③～⑧分別為缺血前0.5,1 h組、缺血同時(shí)組、再灌注同時(shí)、再灌后0.5 h組、再灌后1 h組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)腹腔給予Pd-Ia 5 mg/kg。

1.2.3 神經(jīng)功能缺失評分 參照Bederson等[9]建立的分級法于缺血再灌注24 h后對各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分。0:無癥狀;1:提尾時(shí),損傷對側(cè)前肢不能伸直;2:向損傷對側(cè)推力下降;3:向損傷對側(cè)轉(zhuǎn)圈。

1.2.4 腦梗死灶體積及腦水腫的測定 采用小鼠腦片TTC染色法。小鼠于再灌注24 h后斷頭取腦,迅速置-18℃冷凍,15 min后取出在冰臺(tái)上由前向后切成2.0 mm厚的切片5片,將切片立即置于1%TTC中避光37℃恒溫孵育30 min。未受損的正常腦組織染色后呈紅色,梗死組織不著色而呈白色。而后放入4%多聚甲醛中避光保存24 h,經(jīng)數(shù)碼相機(jī)拍照并輸入電腦,應(yīng)用圖像處理與分析軟件計(jì)算腦片梗死區(qū)域面積及兩側(cè)半球的面積,將每一腦片的梗死面積或半球面積乘以間隔的厚度(2 mm),再將各腦片數(shù)值相加,得到腦梗死體積及腦半球體積的近似值。用“(損傷側(cè)腦半球體積-非損傷側(cè)腦半球體積)/非損傷側(cè)腦半球體積”來反映腦水腫程度。1.2.5 血清中SOD、MDA的測定 血清中SOD活性及MDA含量分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法進(jìn)行測定,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Pd-Ia對腦缺血小鼠神經(jīng)功能缺失評分的影響

缺血再灌注后,小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀,主要表現(xiàn)為提尾懸空時(shí)的強(qiáng)迫體態(tài)—左前肢緊貼軀體向左側(cè)扭轉(zhuǎn)以及運(yùn)動(dòng)時(shí)的追尾征—向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒。Pd-Ia(5,10 mg/kg)缺血前0.5 h給藥能顯著減輕小鼠神經(jīng)功能損傷(P＜0.01);Pd-Ia(5 mg/kg)缺血前0.5 h、缺血同時(shí)、再灌注同時(shí)及再灌注后0.5 h給藥,均可改善明顯小鼠神經(jīng)功能損傷(P＜0.05或 P＜0.01),結(jié)果見表1。

2.2 Pd-Ia對腦缺血小鼠腦梗死體積的影響

缺血再灌注后,小鼠缺血側(cè)額頂葉皮層和皮層下區(qū)(紋狀體,海馬等)可見明顯的蒼白梗死灶。Pd-Ia(5,10 mg/kg)缺血前0.5 h給藥能顯著減小腦梗死體積(P＜0.01),其中以5 mg/kg給藥改善作用最明顯,結(jié)果見表 1。Pd-Ia(5,10 mg/kg)缺血前0.5 h給藥能顯著降低大腦皮層梗死體積分別達(dá)73.48%和62.98%(P＜0.01),而對皮層下區(qū)梗死體積只降低26.28%和1.92%(P＞0.05),結(jié)果見表 2。Pd-Ia(5 mg/kg)不同時(shí)間點(diǎn)給藥,在缺血前1,0.5 h、缺血同時(shí)、再灌注同時(shí)及再灌后0.5 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)給藥均能顯著減小腦梗死體積(P＜0.01),結(jié)果見表1。

表1 Pd-Ia對小鼠MCAO后神經(jīng)功能缺失評分,腦梗死體積,腦水腫程度的影響(n=8,)Tab.1 Effects of Pd-Ia on neurological deficit score,infarct volum and brain edema after MCAO in mice(n=8,)

表1 Pd-Ia對小鼠MCAO后神經(jīng)功能缺失評分,腦梗死體積,腦水腫程度的影響(n=8,)Tab.1 Effects of Pd-Ia on neurological deficit score,infarct volum and brain edema after MCAO in mice(n=8,)

與假手術(shù)組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組比較:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs sham group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

組別 劑量/(mg/kg) 神經(jīng)功能缺失評分 腦梗死體積/mm3 腦水腫程度/%假手術(shù)組 - 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 - 2.80±0.692 188.00±44.192 16.70±3.552 Pd-Ia高劑量組 10 1.40±0.522,4 82.43±18.442,4 11.39±1.902,4 Pd-Ia中劑量組 5 1.20±0.522,4 71.43±20.182,4 10.46±3.202,4 Pd-Ia低劑量組 1 2.40±0.422 166.80±42.192 15.38±2.712缺血前1 h組 5 1.63±0.512 79.00±48.672,4 9.42±3.112缺血前0.5 h組 5 1.28±0.692,4 62.67±25.372,4 8.45±3.102,3缺血同時(shí)組 5 0.94±0.321,4 49.67±26.334 5.53±1.742,4再灌同時(shí)組 5 0.88±0.231,4 47.67±16.824 4.47±1.371,4再灌后0.5 h組 5 1.50±0.532,3 70.29±18.562,4 8.37±2.102,3再灌后1 h組 5 1.61±0.672 118.70±54.512 11.65±2.692

2.3 Pd-Ia對腦缺血小鼠腦水腫程度的影響

缺血再灌注后,小鼠損傷側(cè)腦組織可見明顯水腫,結(jié)果見表1。Pd-Ia(5,10 mg/kg)缺血前0.5 h給藥能顯著減輕腦水腫程度(P＜0.01),且以5 mg/kg給藥改善作用最明顯。Pd-Ia(5 mg/kg)缺血前0.5 h、缺血同時(shí)、再灌注同時(shí)及再灌后0.5 h給藥,均可減輕腦水腫程度(P＜0.05或P＜0.01),其中以再灌注同時(shí)給藥效果最顯著,與模型組比,其降低腦水腫程度達(dá)63.04%。

2.4 不同劑量Pd-Ia對腦缺血損傷小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較,缺血損傷組小鼠血清中SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,Pd-Ia(5,10 mg/kg)給藥均能明顯提高SOD活性,降低MDA含量(P＜0.05或P＜0.01),結(jié)果見表2。

表2 Pd-Ia對小鼠MCAO后皮層和皮層下區(qū)域梗死體積及血清中SOD活性和MDA含量的影響(n=8,)Tab.2 Effects of Pd-Ia on cortical and subcortical infarct volume,the activities of SOD and the contents ofMDA after MCAO in mice(n=8,)

表2 Pd-Ia對小鼠MCAO后皮層和皮層下區(qū)域梗死體積及血清中SOD活性和MDA含量的影響(n=8,)Tab.2 Effects of Pd-Ia on cortical and subcortical infarct volume,the activities of SOD and the contents ofMDA after MCAO in mice(n=8,)

與假手術(shù)組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組比較:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs sham group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典腦缺血模型—小鼠MCAO模型,觀察了鈣阻滯劑Pd-Ia對腦缺血損傷的作用及特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Pd-Ia對腦缺血損傷小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的有效劑量為5和10 mg/kg,小劑量(1 mg/kg)無保護(hù)作用。并發(fā)現(xiàn)劑量為5 mg/kg時(shí)的保護(hù)作用要比10 mg/kg時(shí)明顯,提示在一定劑量范圍內(nèi)Pd-Ia的治療效應(yīng)隨劑量增加而增大,但超過該限度,隨著其劑量的增加,抗腦缺血的效應(yīng)卻不一定增強(qiáng)。Pd-Ia在腦缺血小鼠的用量應(yīng)在5 mg/kg左右,此劑量抗腦缺血作用最明顯。另外還發(fā)現(xiàn)Pd-Ia對腦缺血損傷的改善部位在皮層區(qū)域,而對皮層下區(qū)域沒有改善作用。其原因可能是作為腦缺血中心部位的紋狀體和海馬損傷較為嚴(yán)重,藥物難以改善;而位于缺血周邊區(qū)的腦皮質(zhì)區(qū)損傷較輕,藥物可發(fā)揮明顯的保護(hù)作用,是藥物重點(diǎn)救治的部位。

另外,本實(shí)驗(yàn)還觀察了Pd-Ia神經(jīng)保護(hù)作用的時(shí)間窗。Pd-Ia在缺血前0.5 h、缺血同時(shí)及再灌注同時(shí)給藥均能改善小鼠神經(jīng)功能損傷,減小腦梗死體積和減輕腦水腫程度,其中以再灌注同時(shí)給藥效果最顯著;而在缺血前1 h只對腦梗死體積具有改善作用而不能減輕神經(jīng)功能缺失和腦水腫程度。這些結(jié)果提示Pd-Ia抗腦缺血損傷具有較寬的治療時(shí)間窗,最佳的救治時(shí)間點(diǎn)是再灌注同時(shí)。研究表明,腦缺血后,腦組織從可逆性損傷到不可逆性損傷轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期是恢復(fù)血供過程,而非缺血過程。因此,再灌注同時(shí)應(yīng)是藥物救治的關(guān)鍵時(shí)機(jī)[10]。本研究結(jié)果也表明Pd-Ia在再灌注同時(shí)給藥,其抗腦缺血損傷效果最為顯著,掌握好這一最佳的治療時(shí)間點(diǎn)是Pd-Ia發(fā)揮腦缺血損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Pd-Ia能顯著提高腦缺血損傷小鼠血清中SOD活性,減少氧自由基作用于膜脂質(zhì)生成的MDA,故可增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基的清除功能。這從側(cè)面為Pd-Ia具有保護(hù)腦缺血損傷提供了理論依據(jù)。此外,Pd-Ia作為Ca2+通道阻滯劑和K+通道開放劑還有可能通過阻滯Ca2+內(nèi)流使細(xì)胞Ca2+減少,繼而減少因蛋白水解酶引起黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化,減少活性氧的產(chǎn)生;通過激活A(yù)TP敏感性K+通道(K-ATP)抑制腦缺血時(shí)白細(xì)胞介導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生并減少自由脂肪酸等有害代謝物形成[11]。

綜上所述,Pd-Ia具有抗腦缺血損傷作用,對小鼠治療的最佳劑量為5 mg/kg,最佳治療時(shí)間點(diǎn)是再灌注同時(shí);Pd-Ia還可以提高腦缺血損傷小鼠血清中SOD活性,降低MDA含量。因此,提高腦缺血后的抗氧化水平等可能是Pd-Ia抗腦缺血損傷作用的機(jī)制之一。

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