李 恒,和七一,余曉東,柳建平,宋錫迅,文浩平,鄧疆渝

(重慶市動物生物學(xué)重點實驗室,重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心,重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶 400047)

蛇毒是由多種蛋白質(zhì)、酶類、肽類及小分子物質(zhì)組成的混合物,并對血凝、纖溶和血小板聚集等發(fā)生作用而導(dǎo)致凝血或出血。蛇毒5′-核苷酸酶因可抑制血小板聚集,起到抗凝血作用而受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。目前,已從多種蛇毒如蝰蛇(Vipera aspis)蛇毒[1]、棕點竹葉青蛇(Trimeresurus gramineus)蛇毒[2]、竹葉青云南亞種(T.stejnegeri yunnanensis)蛇毒[3]、眼鏡蛇(Naja naja)蛇毒[4]中檢測并分離純化出了 5′-核苷酸酶。研究發(fā)現(xiàn),不同來源的 5′-核苷酸酶均能抑制血小板聚集,但其抑制血小板聚集的機制有所不同。在前期工作中[5],我們從重慶產(chǎn)的白唇竹葉青(T.albolabris)蛇毒中分離純化出了5′-核苷酸酶,對其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究。本文探討5′-核苷酸酶對血小板聚集的影響及作用機制。

1 材 料

白唇竹葉青蛇毒 5′-核苷酸酶,自制;二磷酸腺苷(ADP),Amresco公司;血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)、磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶(CP/CPK)、阿司匹林,Sigma公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

健康家兔,體重(5000±20)g,購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

Himac CR22E高速冷凍離心機,日本日立公司;Biologic Duoflow蛋白純化系統(tǒng),美國 Bio-rad公司;LBY-NJ4血小板聚集儀,北京普利生儀器有限公司;8500型紫外分光光度計,上海天美科學(xué)儀器有限公司;Waters 600高效液相色譜儀,美國Waters公司。

2 方 法

2.1 樣品制備

白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶的制備按本實驗室方法[5],采用 DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50等3步柱色譜法,從白唇竹葉青蛇毒中分離純化出了經(jīng)SDS-PAGE電泳和高效液相色譜檢測呈單一條帶的組分。蛋白含量按照Lowry法[6]測定。

2.2 富血小板血漿(PRP)制備

健康家兔采用心臟取血,收集于硅烷化的塑料管內(nèi),并以3.8%檸檬酸鈉抗凝,取血量與抗凝劑的比例為9∶1,立即顛倒充分混勻。用水平離心機1000 r/min離心10 min。待離心機自然停止后取出樣本,上層液即為PRP。小心吸取上層液,用血小板計數(shù)儀計數(shù)其血小板數(shù)量,實驗中PRP的血小板數(shù)調(diào)整為50萬/mm3左右。

2.3 貧血小板血漿(PPP)的制備

將吸取PRP后剩余血液3000 r/min離心15 min。待離心機自然停止后取出樣本,上層無血小板的血漿即為PPP,吸取上層PPP作為測定時對照或用于調(diào)整PRP中血小板數(shù)。

2.4 洗滌血小板懸液的制備

制備出PRP后,再以3000 r/min離心10 min,沉淀血小板,棄上層血漿。加苔氏洗滌液至原體積洗滌2遍,沖散團塊。再離心沉淀后以苔氏懸浮液懸浮供實驗用。苔式懸浮液的配制:138 mmol/L NaCl,29 mmol/L KCl,12 mmol/L NaHCO3,0.36 mmol/L NaH2PO4,5 mmol/L葡萄糖,pH 7.4。

2.5 血小板聚集性測定

按Born氏比濁法原理[7],采用LBY-NJ4血小板聚集儀進(jìn)行測定。取PRP 270 μ L加入聚集管中,試驗組分別加入不同濃度的5′-核苷酸酶(25,50,100 μ g/mL)30 μ L,腺苷組加入 100 μ mol/L 腺苷 30 μ L,阿司匹林組加入 100 μ mol/L阿司匹林30 μ L,對照組加入緩沖液30 μ L,孵育5 min,再加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑ADP(20 μ mol/L)、AA(100 μ g/mL)和 PAF(4.5 nmol/L)各5 μ L。用血小板聚集儀測定5 min的最大聚集率,計算樣品對血小板的抑制率。抑制率(%)=(對照最大聚集百分率-加抑制劑最大聚集抑制百分率)/對照最大聚集百分率×100%。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 對ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的家兔PRP聚集的影響

結(jié)果見表1。白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的血小板聚集具有明顯的抑制作用,抑制率與5′-核苷酸酶劑量成正相關(guān)。

3.2 對家兔洗滌血小板聚集的影響

結(jié)果見表2。在家兔洗滌血小板中,白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶僅對ADP(20 μ mol/L)誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制作用(P＜0.01),而對AA(100 μ g/mL)、PAF(4.5 nmol/L)誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯抑制作用。

表1 白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的家兔PRP中血小板聚集的影響(n=3,)Tab.1 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3,)

表1 白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的家兔PRP中血小板聚集的影響(n=3,)Tab.1 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3,)

與對照組比較:1P＜0.05,2P＜0.01Compared with the control group:1P＜0.05,2P＜0.01

組別 劑量 誘導(dǎo)劑 聚集率/% 抑制率/%對照組腺苷組阿司匹林組5′-核苷酸酶組-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL ADP(20 μ mol/L)51.7±7.39.5±0.22 50.1±2.534.1±3.62 30.6±6.92 2.3±1.52-81.7±2.84.0±6.234.1±3.440.9±2.995.6±0.2對照組腺苷組阿司匹林組5′-核苷酸酶組-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL AA(100 μ g/mL)68.2±5.89.4±2.22 5.3±1.62 54.6±8.01 40.9±6.52 26.3±4.32-86.3±3.692.2±3.819.9±4.640.0±3.261.4±2.5對照組腺苷組阿司匹林組5′-核苷酸酶組-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL PAF(4.5 nmol/L)72.3±4.445.7±4.32 70.8±3.357.1±5.61 34.3±3.12 15.7±6.72-36.8±1.62.1±4.221.0±3.852.6±2.278.3±6.3

表2 白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的家兔洗滌血小板聚集的影響(n=3,)Tab.2 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit washed platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3)

表2 白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的家兔洗滌血小板聚集的影響(n=3,)Tab.2 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit washed platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3)

與對照組比較:1P＜0.01Compared with the control group:1P＜0.01

組別 誘導(dǎo)劑 聚集率/% 抑制率/%對照組5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)ADP(20 μ mol/L)52.4±5.33.2±1.71-93.8±3.2對照組5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)AA(100μ g/mL)62.2±3.861.3±2.3-1.4±2.6對照組5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)PAF(4.5 nmol/L)72.5±2.265.8±5.2-9.2±4.3

3.3 CP/CPK對家兔PRP血小板聚集的影響

CP/CPK是ADP清除劑,它能抑制ADP(20 μ mol/L)誘導(dǎo)的血小板聚集。對 AA(100 μ g/mL)、PAF(4.5 nmol/L)誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯抑制作用(圖1)。

圖1 CP/CPK對不同誘導(dǎo)劑ADP(A)、AA(B)和PAF(C)誘導(dǎo)的家兔PRP血小板聚集的影響Fig.1 The effect of CP/CPK on rabbit platelet aggregations induced by ADP(A),AA(B)and PAF(C)

4 討 論

近年來發(fā)現(xiàn)蛇毒中有許多組分可以直接作用于血小板,發(fā)揮促凝和抗凝血作用[8]。其中,蛇毒5′-核苷酸酶通過作用于血小板發(fā)揮抗凝血作用。Ouyang等[2]對棕點竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶的研究發(fā)現(xiàn),該酶可以抑制由ADP、AA、膠原蛋白、低濃度凝血酶和Ionophor(A-23187)誘導(dǎo)的血小板聚集。余曉東等[3]發(fā)現(xiàn)竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶能抑制ADP、AA、TMVA、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。Dhananjaya等[4]報道了眼鏡蛇(Naja naja)毒的5′-核苷酸酶具有抗凝血作用。本研究表明白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的家兔PRP的聚集有明顯的抑制作用,且抑制率與5′-核苷酸酶劑量呈正相關(guān)。

Ouyang等[2]研究發(fā)現(xiàn),棕點竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶水解ADP后的混合物含有ADP、AMP和腺苷等成分,推論5′-核苷酸酶對血小板聚集的抑制作用,除了通過清除血小板聚集誘導(dǎo)劑ADP外,主要與其水解AMP,積累腺苷有關(guān)。另外,Packham等[9]報道,在血漿中ADP主要轉(zhuǎn)化成AMP和腺苷,而在血小板懸浮中則主要轉(zhuǎn)化成ATP。在洗滌血小板懸浮液中,白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶僅抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集,對AA、PAF誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯的抑制作用,因而推斷與洗滌血小板懸浮液中5′-核苷酸酶無法利用血漿中的AMP、積累足夠量的腺苷有關(guān)。

由于5′-核苷酸酶作用于ADP及AMP的終產(chǎn)物為腺苷。我們用腺苷對家兔血小板進(jìn)行研究,結(jié)果表明腺苷對由ADP、AA。PAF誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用。與Born[10]和余曉東等[3]的報道一致。證實5′-核苷酸酶對血小板聚集的抑制作用與腺苷的積累有關(guān)。

CP/CPK是ADP清除劑,它能抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶與ADP清除系統(tǒng)CP/CPK對血小板抑制作用不同的是CP/CPK僅抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集,對AA、PAF誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯抑制作用。而白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶對ADP、AA和PAF等分別誘導(dǎo)的家免PRP血小板聚集均有明顯的抑制作用,從而表明白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶抑制血小板聚集不僅通過水解ADP,還可能與其它物質(zhì)有關(guān)。

阿司匹林主要是抑制環(huán)氧化酶的作用,能夠阻斷TXA2的生成和血小板的第二相聚集,從而阻斷了血小板聚集的TXA2途徑。在用阿司匹林處理由ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的家兔PRP的聚集實驗中,AA誘導(dǎo)的家兔PSP的聚集受到了明顯的抑制,ADP和PAF誘導(dǎo)的家兔PRP的聚集則無明顯的抑制作用。這與白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶的抑制作用有所不同,從而表明5′-核苷酸酶抑制血小板聚集還有可能通過阻斷TXA2途徑,這還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]Boffa M C,Boffa G A.Correlations between the enzymatic activities and the factors active on blood coagulation and platelet aggregation from the venom of Vipera aspis[J].Biochem Biophys Acta,1974,354(2):275-290.

[2]Ouyang C,Huang T F.Inhibition of platelet aggregation by 5′-nucleotidase purified from Trimeresurus gramineus snake venom[J].Toxicon,1983,21(4):491-501.

[3]余曉東,黃立農(nóng),熊郁良.竹葉青(Trimeresurus Stejnegeri)蛇毒5′-核苷酸酶對血小板聚集功能的抑制機制研究[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1997,14(2):61-68.

[4]Dhananjaya B L,Nataraju A,Rajesh R,et al.Anticoagulant effect of Naja naja venom 5′-nucleotidase:demonstration through the use of novel specific inhibitor,vanillic acid[J].Toxicon,2006,48(4):411-421.

[5]陳夏,余曉東,鄧敏,等.白唇竹葉青蛇毒5′-核苷酸酶的分離純化及性質(zhì)[J].動物學(xué)研究,2008,29(4):399-404.

[6]Lowry O H,Rosebrough N J,FarrA L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1):263-275.

[7]Born G V R.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its recersal[J].Nature,1962,194(4832):927-929.

[8]Oyama E,Takahashi H.Distribution of low molecular weight platelet aggregation inhibitors from snake venoms[J].Toxicon,2007,49(3):293-298.

[9]PackhamM A,Ardlie N G,Mustard J F.Effect of adenosine compounds on platelet aggregation[J].Am J Physiol,1969,217(4):1009-1017.

[10]Born G V R,Cross M J.The aggregation of blood platelets[J].J Physiol,1963,168(1):178-195.