賀中民 謝艷華 王四旺 楊 倩 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所(西安 710032)

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品 龍星膠囊藥粉,由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所提供,準(zhǔn)文號(hào):20080321,臨用前用蒸餾水配成不同濃度備用。

1.2 陽性對照藥 消栓通絡(luò)片,批號(hào):20080601。

1.3 試劑 戊巴比妥鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào) WS20080401;膠原蛋白,Sigma,批號(hào):-9879;鹽酸腎上腺素,批號(hào):0809301;冰醋酸,批號(hào):080831;氫氧化鈉,批號(hào):2008228;活化部分凝血活酶(APT T)時(shí)間測定試劑盒,北京世帝科學(xué)儀器公司,批號(hào):ST20201-22;凝血酶原(PT)時(shí)間測定試劑盒,北京世帝科學(xué)儀器公司,批號(hào):STG10101-27;凝血酶(T T)時(shí)間測定試劑盒,北京世帝科學(xué)儀器公司,批號(hào):STG20802-19;血小板誘導(dǎo)劑(ADP),北京世帝科學(xué)儀器公司。

1.4 儀器 德國 Sartorius電子天平(感量 0.1mg);TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī),湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;鉆石牌秒表(上海秒表廠);德國 Axioskop40蔡司顯微鏡;血小板聚集 /凝血因子分析儀(北京中勤世帝有限公司);CBV-1500A高性能無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái),上海瑞仰凈化裝備有限公司;日立 KY2000型半自動(dòng)生化分析儀。

1.5 動(dòng)物 二級昆明種小鼠,雄雌各半,體重18～ 22g;SD大鼠 ,雌雄各半 ,體重 250～ 350g,均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,生產(chǎn)合格證號(hào):scxk(軍 )字 第 2002-005號(hào)。

2 方法和結(jié)果

2.1 龍星膠囊對凝血功能的影響 60只小鼠隨機(jī)分為正常、陽性、消栓通 0.25g/kg、0.50g/kg、1.00g/kg五組,每組 12只,每天給藥 1次,連續(xù)給藥14d,于末次給藥后 1h,將小鼠尾尖 1cm處用利剪剪斷,立即秒表開始計(jì)時(shí),至血液凝固為止即為出血時(shí)間[1]。血液自動(dòng)流出,用濾紙吸去第 1滴血后,將血滴于清潔載玻片兩端各 1滴,立即秒表開始計(jì)時(shí),用 6號(hào)干燥針頭沿血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)血滴,至針頭能挑起纖維蛋白絲為止,即為凝血時(shí)間。

結(jié)果(見表 1)顯示龍星膠囊 0.50g/kg、1.00g/kg給藥 14d與正常對照組比較,有明顯延長小鼠凝血及出血時(shí)間的趨勢(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 龍星膠囊對小鼠凝血時(shí)間的影響(±s;n=12)

表1 龍星膠囊對小鼠凝血時(shí)間的影響(±s;n=12)

注:與正常組比較,△P＜0.05,▲P＜0.01。

組 別 劑量(g/kg) 出血時(shí)間(S) 凝血時(shí)間(S)正常對照 - 1150.58±40.52 127.75±65.92小劑量組 0.25g/kg 1225.00±38.00 171.80±67.51中劑量組 0.50g/kg 1528.70± 40.16▲ 183.70± 37.94△大劑量組 1.00g/kg 1550.00± 44.33▲ 215.18± 99.71△陽性組 1.00g/kg 1403.18± 39.51△ 204.18± 82.52△

2.2 龍星膠囊對血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的影響 60只 SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組、龍星膠囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg六個(gè)劑量組,除正常對照組外,各組均造成血瘀模型。造模:參照文獻(xiàn)[2]復(fù)制血瘀模型,但鹽酸腎上腺素(Adr)的劑量及冰凍時(shí)間有所改變,具體操作如下:將1mg/mL的 Adr用生理鹽水稀釋 1倍,第 1d每隔 4h皮下注射 0.2mL稀釋后的 Adr,共給 3次,在每 2次給藥的中間時(shí)間將大鼠放入 0～2℃冰水中 4min進(jìn)行冷刺激;第 2d仍按前日劑量給予 2次 Adr(間隔 4h),在 2次給藥的中間時(shí)間將大鼠放入冰水中 3min進(jìn)行1次冷刺激,模型即造成。 48h后大鼠 1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)行腹腔麻醉,腹腔靜脈取血,置于 3.8枸櫞酸鈉抗凝管中。離心,測定血小板聚集率和凝血因子[3]。

結(jié)果(見表 2～3)與正常組比較,模型組血液中T T、PT、APT T內(nèi)源性和外源性凝血功能明顯縮短,血小板聚集率顯著增高;龍星膠囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg均能明顯降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性,降低血小板聚集率,抑制內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng),降低血液高凝狀態(tài),與模型組比較有明顯差異(P＜ 0.05或 P ＜0.01)。

表2 龍星膠囊對血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s;n=10)

表2 龍星膠囊對血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s;n=10)

注:與正常組比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與模型組比較◇P ＜ 0.05,◆P ＜0.01。

組 別 劑 量 血小板聚集率(%)正常組 - 16.73± 3.04模型組 - 27.36± 4.68▲小劑量組 0.20g/kg 21.26± 2.14△◇中劑量組 0.40g/kg 19.13± 3.55△◆大劑量組 0.80g/kg 18.55± 3.20◆陽性組 0.80g/kg 23.24± 2.82▲◇

表3 龍星膠囊對血瘀大鼠凝血因子的影響(±s;n=10)

表3 龍星膠囊對血瘀大鼠凝血因子的影響(±s;n=10)

注:與正常組比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與模型組比較 ,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

組 別 劑 量 TT(s) PT(s) APTT(s)正常組 — 30.06±2.78 15.21± 1.90 36.84±3.91模型組 — 20.25±7.83▲ 7.40± 0.35▲ 25.93± 2.09▲小劑量組 0.20g/kg 28.05±5.19◇ 11.20±1.07◇ 30.81±3.39△◇中劑量組 0.40g/kg 30.74±3.09◆ 14.76±1.33◆ 36.01± 2.49◆大劑量組 0.80g/kg 29.30±2.69◆ 15.10±1.50◆ 37.25± 1.34◆陽性組 0.80g/kg 27.16±3.38△◇ 17.38± 1.77△◇ 35.00± 2.32◆

表4 龍星膠囊對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響(n=10)

2.3 龍星膠囊對膠原蛋白-腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的影響 取小鼠 60只,雌雄各半,隨機(jī)分成正常組、陽性組、龍星膠囊 0.25g/kg、0.50g/kg、1.00g/kg五組,給藥 14d,各組于末次給藥后 1h,每只小鼠尾靜脈注射膠原蛋白-腎上腺素混合血栓誘導(dǎo)劑[4](制備方法:稱取Ⅰ型膠原蛋白 0.3g,加 6%醋酸液 60m L,浸泡過夜。研磨勻漿,4800r/min,取上清液冰箱 2℃保存。臨用前以 20%NaOH調(diào) pH后,以 8uL/0.2mL膠原蛋白比例加入鹽酸腎上腺素注射液,混合即得)0.1m L/10g,觀察注射后小鼠反應(yīng),小鼠死亡或15min內(nèi)后肢麻痹未恢復(fù)者為陽性,15min內(nèi)恢復(fù)者為陰性。計(jì)算存活率(即對血栓形成的保護(hù)率)。

結(jié)果(見表 4)表明龍星膠囊 0.50g/kg、1.00g/kg給藥 14d與模型組比較,能明顯增加小鼠存活率(P＜0.05或 P ＜ 0.01)。

3 討 論

近年來以冠脈血栓和腦血栓為主的血栓栓塞性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢,嚴(yán)重危害人類的健康。血小板的粘附、聚集、釋放反應(yīng)可導(dǎo)致血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病[5]。因此活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)是其主要的治療原則。龍星膠囊由地龍、僵蠶、天南星(制)、水蛭等組成,具有活血化瘀,溫經(jīng)通絡(luò),祛風(fēng)定驚,散結(jié)止痛的功效,用于治療腦血栓引起的精神呆滯、舌質(zhì)發(fā)硬、言語遲澀、發(fā)音不清、口眼歪斜、肢體麻木,半身不遂及動(dòng)脈硬化癥。臨床上取得了良好的療效。

對大鼠造成血瘀模型,發(fā)現(xiàn)與正常組比較,模型組血液中 TT、PT、APTT內(nèi)源性和外源性凝血功能明顯縮短,血小板聚集率顯著增高;龍星膠囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg均能明顯降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性,降低血小板聚集率,抑制內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng),降低血液高凝狀態(tài),與模型組比較有明顯差異(P＜0.05或 P＜0.01)。凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,龍星膠囊 0.50g/kg、1.00g/kg給藥 14d與正常對照組比較,有明顯延長小鼠凝血及出血時(shí)間的趨勢(P＜0.05或 P＜0.01)。膠原蛋白-腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成結(jié)果,表明龍星膠囊 0.5g/kg、1.0g/kg給藥 14d與模型組比較,能明顯增加小鼠存活率(P＜0.05或 P＜0.01)。表明龍星膠囊可以在活體中顯示出抗血栓作用,本實(shí)驗(yàn)為龍星膠囊的臨床療效提供了藥理學(xué)依據(jù)。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南(藥學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué))[M].1994:172.

[2] 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:564-566.

[3] 張強(qiáng)宗,劉俊田,史小蓮,等.水蛭免加熱提取物對高凝動(dòng)物模型凝血系統(tǒng)及血小板聚集率的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(5):47-49.

[4] 謝 輝,許惠琴 ,李 虹.薤白提取物對小鼠凝血時(shí)間及體內(nèi)血栓形成的影響 [J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2004,15(12):811-812.

[5] 陳領(lǐng)朝,連秀峰,袁秉祥,等.腦絡(luò)舒通膠囊對大鼠實(shí)驗(yàn)性腦及動(dòng)靜脈血栓形成的藥效與研究[J].陜西中醫(yī),2002,23(4):376-377.