李天洙 許青松 崔 永 延邊大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院(延吉 133000)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus,Chaga),主要分布于北緯 45～50度的地區(qū),如北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯、日本等國家和地區(qū),在我國主要分布在黑龍江和吉林省長白山地區(qū),民間廣泛用于防治癌癥等多種疑難雜癥[1]。樺褐孔菌提取物具有很多生物活性,如增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒(主要是 H IV)、抗氧化、抑制血小板聚集、抗炎、抗損傷等作用。本實驗通過測定糖尿病豚鼠 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C等糖、脂代謝生化指標及 GK、HM G Co A還原酶表達,初步探討樺褐孔菌水提取物糾正糖尿病豚鼠糖、脂類代謝紊亂的生物化學機制,為樺褐孔菌的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料 1.1 動物雄性豚鼠 80只,體重 400～500g,由延邊大學醫(yī)學部實驗動物科提供。

1.2 實驗用藥 樺褐孔菌水提取物,由延邊圣林菌業(yè)有限公司提供。

1.3 實驗試劑 STZ(美國 Sigma公司),蛋白質(zhì)提取純化試劑盒(Bioss p1250),GK和 HM G CoA還原酶單克隆抗體(Santa Cruz,USA);其他試劑均應用國產(chǎn)優(yōu)級純試劑。

1.4 實驗儀器全自動生化分析儀(日立7600),糖化血紅蛋白分析儀(Sysmex GT),電泳裝置(Bio-rad)。

2 實驗方法與結果 2.1 制作糖尿病豚鼠模型 糖尿病豚鼠模型制備采用楊麗萍等方法[2],取 FBG≥8.83mmol/L者作為糖尿病成模標準。取造模成功的糖尿病豚鼠 48只(本實驗造模成功 54只),按血糖和體重隨機分為陰性對照組(模型組)、樺褐孔菌水提取物小劑量組、中劑量組、大劑量組及陽性對照組(鹽酸二甲雙胍治療組),每組各 8只 ,樺褐孔菌小劑量組、中劑量組、大劑量組分別灌胃樺褐孔菌水提取物 300mg/kg、600mg/kg、900mg/kg。陽性對照組灌胃鹽酸二甲雙胍200mg/kg,正常對照組和糖尿病模型組每天灌胃相同劑量的蒸餾水 1次,連續(xù) 8周。實驗期間飼以標準飼料、自由飲水及新鮮蔬菜。實驗前取眥靜脈測定各組 FBG、TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。實驗 8周后,各組禁食不禁水 12h,麻醉后心臟取血測量 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C水平,取豚鼠肝臟,蛋白質(zhì)印跡法測定 GK和 HM G CoA還原酶的表達,以β-actin作為內(nèi)參對照。

2.2 實驗組 FBG和 Hb A1c的變化實驗前后相比較,陽性對照組的 FBG水平顯著下降 (P＜0.01),樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 FBG均明顯下降(P＜0.05);實驗后與陰性對照組比較,陽性對照組的 FBG水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 FBG均明顯下降(P＜0.05),與陰性對照組比較,陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 Hb A1c均明顯下降(P＜0.05),并表現(xiàn)出濃度梯度依賴性。陽性對照組與樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 Hb A1c水平比較無顯著變化,結果見表1。

表1 各實驗組實驗前后 FBG的比較和實驗后 FBG及 HbA 1c的比較(±s)

表1 各實驗組實驗前后 FBG的比較和實驗后 FBG及 HbA 1c的比較(±s)

注:實驗前后比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與陰性對照組實驗后比較,◇P ＜0.05,◆P＜0.01。

正常組8 6.27± 0.386.74± 0.34 8.68± 0.65陰性對照組8 11.68±0.9612.27± 0.53 22.32±1.46陽性對照組8 12.09± 1.138.62± 1.52▲◆ 14.63± 1.84◇藥物小劑量組8 11.95±1.2911.52± 1.44 20.56±1.82藥物中劑量組8 11.38± 1.01 10.21± 1.37△◇ 17.47± 1.73◇藥物大劑量組8 12.14± 1.289.69± 1.25△◇ 15.73± 1.59◇

2.3 實驗組 TG、TC的變化實驗前后相比較,陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 TG水平均顯著減少(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 TG水平均明顯減少(P＜0.05),陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的TC水平均顯著減少(P＜0.01);實驗后,與陰性對照組比較,陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 TG水平顯著減少(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 TG水平均明顯減少(P＜0.05),陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 TC水平均顯著減少(P＜0.01),并表現(xiàn)為濃度梯度依賴性。結果見表2。

表2 各實驗組實驗前后 TG、TC的比較和實驗后 TG、TC的比較±s)

表2 各實驗組實驗前后 TG、TC的比較和實驗后 TG、TC的比較±s)

注:實驗后與實驗前比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與陰性對照組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

TG(mmol/L)TC(mmol/L)分 組n實驗前實驗后實驗前實驗后正 常組8 1.59± 0.071.61± 0.05 1.08± 0.361.11± 0.27陰性對照組8 2.01± 0.101.89± 0.08 2.16± 0.052.23±0.13陽性對照組8 1.88± 0.061.47± 0.11▲◆ 2.11± 0.080.87± 0.12▲◆藥物小劑量組8 1.91±0.121.79±0.09 2.06±0.141.69±0.09藥物中劑量組8 1.93± 0.051.58± 0.07△◇ 1.98± 0.111,41±0.07▲◆藥物大劑量組8 1.89± 0.091.36± 0.11▲◆ 2.02± 0.130.89±0.11▲◆

2.4 實驗組 LDL-C及 HDL-C的變化 實驗前后相比較,陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 LDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 LDL-C均明顯下降(P＜0.05),陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 HDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 HDL-C均明顯下降(P＜0.05);實驗后,與陰性對照組比較,陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 LDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 LDL-C均明顯下降(P＜0.05),陽性對照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 HDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 HDL-C均明顯下降(P＜0.05),并表現(xiàn)出濃度梯度依賴性,結果見表3。

表3 各組實驗前后 LDL-C及 HDL-C的比較和實驗后 LDL-C及 HDL-C的比較(±s)

表3 各組實驗前后 LDL-C及 HDL-C的比較和實驗后 LDL-C及 HDL-C的比較(±s)

注:實驗后與實驗前比較,△(P＜0.05),▲P＜0.01;與陰性對照組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)分 組n實驗前實驗后實驗前實驗后正 常組8 0.75± 0.180.71± 0.31 0.45± 0.140.51± 0.23陰性對照組8 2.68± 0.262.57± 0.13 1.74± 0.211.69±0.16陽性對照組8 2.59± 0.141.21± 0.22▲◆ 1.69± 0.140.85± 0.14▲◆藥物小劑量組8 2.65±0.292.36±0.21 1.79±0.291.53±0.07藥物中劑量組8 2.58± 1.011.96± 0.37△◇ 1.65± 1.011.37±0.23△◇藥物大劑量組8 2.63± 0.251.49± 0.29▲◆ 1.71± 0.251.03±0.19▲◆

2.5 各實驗組 GK和 HM GCoA還原酶表達的變化 實驗后,各實驗組 GK和 HMG CoA還原酶表達情況見圖 1,樺褐孔菌水提取物中、高劑量組 GK表達高于陰性對照組,表現(xiàn)濃度梯度依賴性。陽性對照組和陰性對照組及正常組比較 GK表達無明顯差異,樺褐孔菌水提取物高劑量組 GK表達高于陽性對照組。與此相反,樺褐孔菌水提取物治療組的 HMG CoA還原酶表達呈濃度依賴性減少,樺褐孔菌水提取物高劑量組的HM G Co A還原酶表達均低于陰性對照組、正常組和陽性對照組表達,其中陰性對照組的 HM G Co A還原酶的表達量最多。

圖1 樺褐孔菌水提取物對GK和HMGCoA還原酶表達的影響（蛋白印跡）

3 討 論 糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂引起的代謝性疾病,由于胰島素 /胰高血糖素比值降低,脂肪分解加速,大量脂肪酸和甘油進入肝臟,過多的脂肪酸重新酯化成甘油三酯釋放入血,形成高脂血癥,酮血癥等并發(fā)癥。糖尿病病人由于體內(nèi)生長素、腎上腺素、去甲腎上腺素等激素增多,使膽固醇合成的限速酶-HMG CoA還原酶增加,膽固醇合成增加,增加了動脈粥樣硬化等心血管疾病的危險性。己糖激酶是葡萄糖分解的關鍵酶,共有四種亞型,其中存在于肝臟中的己糖激酶稱為葡萄糖激酶。葡萄糖激酶的表達受 PPARγ等因子的調(diào)節(jié)作用[3],在保持血糖的穩(wěn)定方面起著重要作用。為了探討樺褐孔菌對糖尿病豚鼠降糖、降脂過程的影響,實施了本次實驗。本實驗利用豚鼠制作 STZ糖尿病模型,基于 STZ具有能夠直接破壞胰島細胞導致胰島功能衰竭,對其他組織毒性相對較少,實驗動物存活率高的特點,及豚鼠和其他嚙齒類動物比較,具有對藥物非常敏感的特點。實驗生化指標測定結果表明,樺褐孔菌中、高劑量組的 FBG、HbA1c、TG、TC、LDLC和 HDL-C水平明顯減少,并且具有濃度梯度依賴性,提示樺褐孔菌提取物對糖尿病豚鼠的降低血糖及血脂具有較好的療效,這些內(nèi)容和張香花等研究結果吻合[4,5,6]。蛋白質(zhì)印跡結果表明,樺褐孔菌可增強 GK表達,降低 HMGCoA還原酶表達。推測,GK表達增強,對降低血糖具有促進作用,而血糖水平的改善,可以通過影響體內(nèi)多種激素的代謝,改變 HMGCoA還原酶的表達水平,減少膽固醇的合成。樺褐孔菌含有三萜類、類固醇、甾醇類、多糖類、木質(zhì)素類、黑色素類、多酚類、鞘氨脂類似物、甘露醇、半單寧化合物、栓菌酸、生物堿、葉酸衍生物以及芳香物質(zhì)等多種化學成分。樺褐孔菌提取物能夠影響 GK和 HMGCoA還原酶表達,是否和這些單體成分有關,這些成分是否以單體或復合體的形式參與這些蛋白質(zhì)表達的信號傳導通路或轉錄調(diào)節(jié)過程,還有待于進行其他的相關實驗加以確定。以上分析可以推測,樺褐孔菌水提取物對糖尿病豚鼠降低血糖、血脂水平具有較好療效,其機制之一可能是通過對 GK表達的影響,降低血糖水平,影響體內(nèi)相關激素水平,進而通過改變 HMGCoA還原酶表達或單獨影響 HMGCoA還原酶的表達,達到防治糖尿病的目的。

[1]黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌 [J].中國食用菌,2002,21(4):7-8.

[2]楊麗萍,周文江,衛(wèi)志明.鏈脲佐菌素誘發(fā)豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海實驗動物科學,2001,21(2):111-112.

[3] So-younKim,Ha-ilKim,Sang-KyuPark,etral.LiverGlucokinaseCanBeActivatedbyPeroxisome Proliferator-ActivatedReceptor-γ,DIABETES,2004,53(S1);S66-S70.

[4] 潘艷玲,凌湘力.芪荷地黃湯防治糖尿病脂代謝紊亂的實驗研究 [J].陜西中醫(yī),2008,29(9):1245-1246.

[5]楊景鋒,趙天才,白海俠,等.抵當四五湯對糖尿病血管病變大鼠血液流變性的影響 [J].陜西中醫(yī),2008,29(8):1077-1078.

[6] 張香花,孫東植,陳海月,等.樺褐孔菌提取物對糖尿病大鼠生化指標的影響[J].中國食用菌,2008,27(5):41-43.