田麗華,劉 娟,劉利成

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)生藥學(xué)研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

水蛭素是從水蛭中提取的一種酸性多肽,在臨床上多用于治療不穩(wěn)定性心絞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形成術(shù),血液透析,體外循環(huán),腎移植(CRRT),彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等病癥。

天然水蛭素的分離與純化主要包括從活體水蛭素和干水蛭中分離提取水蛭素。傳統(tǒng)的水蛭素的獲得是對(duì)水蛭的一次性掠奪,而本實(shí)驗(yàn)采用誘導(dǎo)方法對(duì)活體水蛭素的提取,避免了傳統(tǒng)方法對(duì)水蛭的一次性掠奪,保護(hù)了水蛭的野生資源,又帶動(dòng)了水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。國(guó)內(nèi)曾報(bào)道了一種能利用水蛭反復(fù)吸血并用其嗉囊消化液為原料,既不殺死水蛭又能提取批量水蛭素的方法。

水蛭素的含量測(cè)定方法有多種,如生物底色法、凝血酶滴定法、光散射法、酶聯(lián)免疫法吸附測(cè)定法、同位素標(biāo)記示蹤法等。本實(shí)驗(yàn)采用凝血酶滴定法,1970年 Markwardt報(bào)道了凝血酶滴定法,其原理是根據(jù)水蛭素與凝血酶結(jié)合比例為1:1(mol/mol)和1:5(g/g)。凝血酶的國(guó)際單位 N IH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力單位 ATU表示,一個(gè) AU T等于中和一個(gè) N IH凝血酶的水蛭素量。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑

本實(shí)驗(yàn)所用水蛭購(gòu)于山東省濟(jì)寧市,經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室主任劉娟教授鑒定。

BSZ-2型自動(dòng)雙重純水蒸餾儀(上海之信儀器有限公司),5μL微量進(jìn)樣器 (上海安亭微量進(jìn)樣器廠),10μL微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠),酶示板。

凝血酶(北京生物制品研究所);纖維蛋白原(上海市生物制品研究所);雙重蒸餾水(自制);L-精氨酸(北京生物制品研究所);牛腸系膜 (佳木斯肉聯(lián)廠 );氯化鈉(分析純);生理鹽水(黑龍江省肇東市華富藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 誘導(dǎo)法

本實(shí)驗(yàn)對(duì)活體的誘導(dǎo)有兩種方法,一種用不同濃度的氯化鈉溶液組成的誘導(dǎo)系統(tǒng),對(duì)活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo),收集水蛭唾液腺分泌物,測(cè)定水蛭素含量,比較結(jié)果。

另一種是用氯化鈉和 L-精氨酸組成的誘導(dǎo)系統(tǒng),對(duì)活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo),測(cè)定水蛭素含量,比較結(jié)果。

2.1.1 不同濃度的氯化鈉溶液誘導(dǎo)

配制濃度為0.9%的氯化鈉溶液(即生理鹽水),分別稀釋至濃度為0.45%和0.225%的氯化鈉溶液(即1/2生理鹽水和1/4生理鹽水),裝入3個(gè)小試劑瓶里,用牛腸系膜封口組成誘導(dǎo)系統(tǒng),對(duì)活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo),觀察水蛭的反應(yīng),收集其唾液,分別用凝血酶滴定法進(jìn)行含量測(cè)定,選擇最佳誘導(dǎo)條件。

2.1.2 氯化鈉加 L-精氨酸誘導(dǎo)

配制150mm的氯化鈉溶液,分別裝于5個(gè)小試劑瓶中,分別加入 1mmol、 2mmol、 4mmol、 6mmol的 L- 精氨酸 ,用牛腸系膜封口組成誘導(dǎo)系統(tǒng),對(duì)活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo),觀察水蛭的反應(yīng),收集其唾液,分別用凝血酶滴定法進(jìn)行含量測(cè)定,選擇最佳誘導(dǎo)條件。

2.2 凝血酶滴定法

2.2.1 凝血酶滴定法原理

本實(shí)驗(yàn)對(duì)水蛭素的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,在止血時(shí)起中心作用,在凝血酶的分子表面有一個(gè)富含堿性氨基酸的纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn) (FRS)。而水蛭素的 C端含有較多的酸性氨基酸,可以結(jié)合在 FRS上,阻止凝血酶與其底物血纖維蛋白原的相互作用,從而達(dá)到抗凝血的目的。

2.2.2 凝血酶滴定過(guò)程

具體方法如下:配制不同梯度(20NIH/mL,40NIH/mL,80NIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步縮小活性范圍,多次換管重滴的濃度梯度法,對(duì)水蛭素含量進(jìn)行測(cè)定,在酶示板小孔中加200μL0.5%的纖維蛋白原(0.05mol/L)Tris-HCL緩沖液(pH7.4)再加入 10-100μL水蛭素溶液,充分混均。用微量注射器吸取標(biāo)準(zhǔn)的凝血酶溶液(20NIH單位 )5μL(即 0.1NIH單位),若在1min內(nèi)纖維蛋白原發(fā)生凝固,即說(shuō)明已經(jīng)達(dá)到滴定終點(diǎn)。若沒(méi)有發(fā)生凝固,則換取40NIH/mL單位的凝血酶溶液進(jìn)行滴定,若仍沒(méi)有凝固,則逐步擴(kuò)大范圍直至確定活性范圍。

3 結(jié)果

表1 氯化鈉溶液誘導(dǎo)結(jié)果

表2 氯化鈉+L-精氨酸誘導(dǎo)結(jié)果(U=40)

4 結(jié)論

通過(guò)應(yīng)用仿生誘導(dǎo)的方法對(duì)活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo)后比較發(fā)現(xiàn),當(dāng)誘導(dǎo)溶媒為不同濃度氯化鈉溶液時(shí),其最佳的提取濃度為0.9%,也就是生理鹽水組的提取效果較好。當(dāng)誘導(dǎo)溶媒為氯化鈉+L-精氨酸時(shí),發(fā)現(xiàn)150mL NaCl加 4mL-精氨酸組的效果最好,能夠得到最大劑量的水蛭素。綜合兩種誘導(dǎo)溶媒發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)溶媒為氯化鈉+L-精氨酸的效果較好。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)水蛭素含量測(cè)定采用改進(jìn)后的凝血酶滴定法,即逐步縮小活性范圍,多次換管重滴的濃度梯度法,對(duì)水蛭分泌的唾液進(jìn)行含量測(cè)定時(shí),具有節(jié)省時(shí)間,重復(fù)性和準(zhǔn)確度都較好的優(yōu)點(diǎn)。