辛險峰,王進(jìn)全,左會明,王新程,周 雷

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)在讀研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

丙泊酚(P,propofol)作為一種新型的靜脈麻醉藥,因起效快、蘇醒迅速而完全、副作用小,連續(xù)靜脈輸注后無蓄積作用等優(yōu)點,現(xiàn)已經(jīng)普遍用于臨床需要做手術(shù)的全身麻醉,包括門診的小手術(shù)、無痛人流和無痛胃腸鏡檢查等。丙泊酚對缺血再灌注損傷(IRI,ischemia reperfusion injury)的組織或器官有保護(hù)作用已經(jīng)從臨床和實驗研究中得到證實。本實驗是關(guān)于丙泊酚對大鼠腦缺血再灌注時細(xì)胞凋亡(apoptosis)和相關(guān)因子影響的進(jìn)一步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

Bax兔抗鼠單克隆抗體(SC-526),Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體(SC-492),Caspase-3兔抗人多克隆抗體(SC-7148),二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑(PV-9001),DAB顯色劑 (ZLI-9018),(TUN EL)原位細(xì)胞凋亡檢測 (ZK-8005),以上試劑均購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司,丙泊酚注射液(西安力邦制藥有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組

雄性 Wistar大鼠 78只 ,體重 230～ 250g,鼠齡 3～ 4個月 ,由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為3組:對照組(C=6),缺血組(I/R=36),丙泊酚組(P=36);缺血組和丙泊酚組又根據(jù)再灌注的時間不同分為再灌注1h,6h,12h,24h,48h,72h亞組。

1.2.2 模型制備

采用大鼠四條血管阻斷方法(Pulsinelli-4V O)[1]制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛380mg/kg腹腔注入麻醉后,將大鼠俯臥固定 ,備皮,消毒。在枕骨下于平行脊柱沿頸背正中線切開皮膚,皮下肌肉至第一頸椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置將燒灼的細(xì)針直接插入雙側(cè)翼突孔,插入時間在 1～ 2秒即可。并電凝燒閉椎動脈;次日用同樣的麻醉方法處理大鼠后,在頸部正中切口,于雙側(cè)頸動脈鞘出分離雙側(cè)頸動脈,在雙側(cè)頸動脈環(huán)繞絲線并提出頸動脈,用臨時阻斷夾夾閉頸總動脈造成全腦缺血15min,15min后松開阻斷夾恢復(fù)再灌注。P組于缺血前10min腹腔注入丙泊酚110mg/kg,I/R組在缺血前10min腹腔注入等溶劑的生理鹽水。C組不電凝雙側(cè)椎動脈,不夾閉雙側(cè)頸總動脈,其余處理與手術(shù)組相同。

1.2.3 標(biāo)本制作

于再灌注時間點麻醉動物,迅速剪開胸腔暴露心臟,于心尖處剪一小口,插入軟管至主動脈,絲線結(jié)扎固定,剪開右心耳快速向心臟推注肝素化生理鹽水,沖凈血液后,以。4℃4%多聚甲醛灌流30min,斷頭取腦,由視交叉平面冠狀切取約 4mm組織塊,置4%多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋,切片機(jī)做連續(xù)冠狀面切片。

1.2.4 免疫組化及 TUN EL法檢測

免疫組化法檢測 Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白在大鼠海馬 CA1區(qū)的表達(dá)情況,TUN EL法檢測其細(xì)胞的凋亡數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)收集

在 400倍光鏡下計數(shù) CA1區(qū)細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù),計算陽性率(陽性率=陽性細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù)× 100%)。每張切片計數(shù)4個不重疊視野,取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表 1。

表1 各組海馬區(qū) BcL-2,Bax,Caspase-3及 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù) (±s)

表1 各組海馬區(qū) BcL-2,Bax,Caspase-3及 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù) (±s)

① Bcl-2組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h;P48h V S I/R48h;P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h V S I/R1h(P ＜0.05)。② Bax組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h;P48h VS I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h V S I/R12h;P6h VS I/R6h;P1h V S I/R1h(P＜ 0.05)。③ Caspase-3組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較,P72h V S I/R72h;P48h VS I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h VS I/R1h(P ＜0.05)。④ TUN EL組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h:P48h V S I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h V S I/R1h(P ＜ 0.05)。⑤ Bcl-2組內(nèi)不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、 I/R12h、 I/R24h、I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05)。 ,I/R24h VS I/R48h、I/R72h(P ＜ 0.05);P1h V S P6h、 P12h、 P24h、P48h、 P72h、P ＜ 0.05,P24h VS P48h、P72h(P ＜ 0.05)。⑥ Bax組內(nèi)不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72hP ＜ 0.05,I/R24h VS I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05);P1h V S P6h(P ＞ 0.05),P1h V S P12h、 P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h V S P48h、P72h(P ＜ 0.05)。⑦ Caspase-3組內(nèi)不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、 I/R12h、I/R24h、 I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05),I/R24h V S I/R48h、I/R72h P ＜ 0.05;P1h V S P6h(P＞ 0.05),P1h VS P12h、P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h V S P48h、 P72h(P ＜ 0.05)。⑧ TUNEL組間不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h(P ＜ 0.05),I/R24h VS I/R48h(P ＜ 0.05),I/R24h V S I/R72h(P＞ 0.05);P1h V S P6h(P ＜ 0.05),P1h V S P12h、P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h VS P48h、P72h(P ＜ 0.05)。

組別 BcL-2 Bax Caspase-3 TUNEL Bcl-2/Bax I/R1h 9.81± 0.78 27.42± 0.54 27.05± 0.70 37.76± 0.72 0.36 I/R 6h 25.35± 0.59 37.04± 1.16 30.47± 1.62 42.04± 1.09 0.68 I/R 12h 36.09± 0.71 45.04± 1.55 34.60± 0.93 45.84± 1.35 0.80 I/R24h 29.59± 1.89 56.13± 1.26 42.80± 1.22 71.55± 1.72 0.53 I/R 48h 19.96± 0.91 35.92± 1.40 44.52± 0.90 75.45± 2.83 0.56 I/R72h 15.14± 0.44 22.73± 1.92 35.87± 0.87 57.48± 5.36 0.67 P 1h 14.06± 0.70 21.56± 1.14 25.07± 0.79 35.49± 0.42 0.65 P 6h 32.23± 1.71 20.88± 1.00 23.77± 0.95 32.73± 1.41 1.54 P 12h 43.46± 1.11 18.91± 0.94 20.52± 1.13 29.91± 0.41 2.30 P 24h 34.57± 1.46 15.81± 0.76 17.62± 0.99 28.06± 1.09 2.19 P48h 28.41± 1.01 13.43± 1.06 15.12± 1.14 25.16± 0.28 2.12 P 72h 20.35± 1.81 10.19± 1.82 12.27± 1.80 21.23± 1.2 72.00

3 討論

在心肺復(fù)蘇、器官移植、溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、危重病人存在血流灌注不足時以及臨床上腦外科手術(shù)麻醉和腦梗死患者不可避免引起 IRI。缺血可以產(chǎn)生炎癥前反應(yīng),再灌注時進(jìn)一步加重了組織損傷,因此防止器官 IRI是醫(yī)生面臨最嚴(yán)峻的問題。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因的調(diào)控下主動性程序性死亡,受促進(jìn)凋亡基因和抑制凋亡基因的協(xié)調(diào)及雙重調(diào)控。Bax是 Bcl-2家族成員之一。當(dāng)在外界因素的作用下促使Bcl-2高表達(dá),則 Bax蛋白與 Bcl-2和 Bcl-XL蛋白形成異源二聚體可阻止細(xì)胞的凋亡發(fā)生;但假如 Bax蛋白過度表達(dá)導(dǎo)致 Bax和 Bcl-2,Bcl-XL形成同源二聚體而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Caspae-3屬于白介素 Ib轉(zhuǎn)換酶家族成員,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。Caspae酶是一種半胱氨酸蛋白激酶,與啟動凋亡和效應(yīng)階段關(guān)系密切。Caspae-3是促凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要效應(yīng)酶,它的出現(xiàn)是細(xì)胞死亡的標(biāo)志,Caspae-9和 Caspae-8分別啟動細(xì)胞內(nèi)外凋亡通路與 Caspae-3直接相關(guān)。近年的研究表明在 IRI中活化的 Caspae-3可以裂解 Bcl-2,促使線粒體釋放 CytoC促使細(xì)胞凋亡。因此能抑制劑 Caspae-3蛋白和 Bax蛋白的表達(dá),同時又能促使 Bcl-2蛋白表達(dá),改善在 IRI中的作用 ,減少細(xì)胞凋亡,盡可能地保持器官的基本功能。本實驗以對缺血缺氧最敏感的海馬組織作為研究對象,可看出 Bcl-2蛋白的表達(dá)在 I/R組和 P組中都在再灌注12h時達(dá)到最高,其數(shù)值分別是(36.09±0.71)和(43.46±1.11),隨著再灌注時間的增加,表達(dá)逐步下降,但 Bcl-2蛋白表達(dá)在 P組始終高于 I/R組;Bax、Caspae-3和TUN EL在 I/R組分別在 24h、48h、和48h時達(dá)到高峰,其數(shù)值 分別是 (56.13± 1.26)、 (44.52± 0.90)和 (75.45± 2.83),以后隨再灌注的時間增加表達(dá)逐漸減少,而在 P組 Caspae-3和 Bax隨再灌注時間的延長 ,二者的表達(dá)逐步降低,顯著低于 I/R組 Caspae-3和 Bax蛋白表達(dá);此外 TUNEL的實驗結(jié)果也進(jìn)一步證明 P組的大鼠海馬 CA1區(qū)細(xì)胞凋亡程度顯著低于 I/R組;Bcl-2/Bax在 I/R組和 P組都在關(guān)注12h最高,其數(shù)值分別是0.80和2.30,以后隨灌注時間的延長逐漸降低 ,但 P組始終大于 I/R組。丙泊酚作為一種新型的麻醉兼有鎮(zhèn)靜最常用的藥已廣泛用于臨床上。近年研究其在腦保護(hù)方面的研究頗多。其保護(hù)機(jī)制是多位點相互作用的結(jié)果。比如其與維生素 E化學(xué)結(jié)構(gòu)相似具有抗氧化,保護(hù)線粒體和清除自由基的特性;抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸的釋放[2];非選擇性抑制一氧化氮合酶的活性,降低神經(jīng)系統(tǒng)一氧化氮含量;預(yù)防鈣超載。抑制細(xì)胞的凋亡,比如促進(jìn) Bcl-2[3]的蛋白表達(dá),抑制 Caspase-3和 Bax蛋白表達(dá)?？傊?在組織器官缺血再灌注過程中應(yīng)用丙泊酚麻醉藥可減少細(xì)胞的凋亡,對其有保護(hù)作用。

[1]Pulsinelli WA,JamesBA.New model of bilateral hemispheric ischemia in the unanes the tized rat[J].Stroke,1979,10:267

[2]Snyder GL,Galdi S,Hendrick J P,et al.general anaesthetics selectively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via sitespecific phosphorylation in vivo[J].Neuro pharmacology,2007,53(5):619-630

[3]Chen J,Graham SH,Chen PH,et al.Bcl-2 is expression in neurons that survive focal cerebral ischemia the rat[J].Neuroreport,1995,26(2):394-396