毛旭娟,張俊峰,梁建芳,鄭繪霞

(1.山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001;2.山西體育職業(yè)學(xué)院,山西 太原 030006;3.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院,山西 太原 030001)

番茄紅素(lycopene)是目前已知最有效的抗氧化活性物質(zhì),具有極強(qiáng)的清除自由基能力,在抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、延緩衰老等方面有很好的功效。近年來的研究表明,番茄紅素可以通過消除自由基、增強(qiáng)機(jī)體組織抗氧化能力等作用,達(dá)到保護(hù)組織器官的目的。腦缺血再灌注的損傷機(jī)制雖然目前不是十分明確,但發(fā)生氧化損傷、細(xì)胞膜的破壞是大多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)的。本實(shí)驗(yàn)借助大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO),通過觀察番茄紅素對(duì)大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Metalloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá)、腦含水量的影響,來研究探討番茄紅素在腦缺血再灌注損傷中的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑及設(shè)備

雌性 Wistar大鼠 22只,體重230 g～330 g,購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周,隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(sham組)6只,缺血再灌注組(IR組)8只,番茄紅素組(LP組)8只。實(shí)驗(yàn)造模完成,動(dòng)物蘇醒后參考 Longa5分評(píng)分法,2分或 2分以上者入選本實(shí)驗(yàn),2分以下者剔除。所有手術(shù)組大鼠經(jīng)取腦證實(shí)有明確梗塞灶者,被最終確認(rèn)入選實(shí)驗(yàn)分析,否則棄去所有數(shù)據(jù),補(bǔ)充動(dòng)物。番茄紅素(北京威創(chuàng)康比特公司),MMP-9抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)SABC染色試劑盒、DAB顯示試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型制作方法

線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO),缺血2 h后再灌注。基本步驟:大鼠于手術(shù)前12 h禁食,隨意進(jìn)水;稱重后,用 10%水合氯醛(4m L/kg)腹腔麻醉;剪去頸前部手術(shù)區(qū)毛發(fā),消毒皮膚并于頸部行25mm常規(guī)縱行切口,暴露并鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA);結(jié)扎 ECA與 CCA,用動(dòng)脈夾夾閉 ICA遠(yuǎn)心端;迅速于 ECA與ICA分叉下方剪一切口,將一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈,去除動(dòng)脈夾,插入深度為(18±0.5)mm,直到有輕微阻力感為止,實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處,尼龍線外留約1 cm,將慶大霉素注射于傷口處,全層縫合傷口。2 h后輕輕提拉所留線頭至 CCA,由對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈系統(tǒng)、基底動(dòng)脈經(jīng)過 Willis共同維持損傷側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng),實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注,造模完成。

1.3 給藥方法

LP組于術(shù)前給番茄紅素7.2mg/(kg?d)灌胃 1周[1],最后一次灌胃后30 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。IR組缺血2 h再灌注22 h,術(shù)前等量生理鹽水灌胃 1周;sham組只結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈,不插入線,其他操作與IR組相同。

1.4 取材和指標(biāo)的檢測(cè)

大鼠腦缺血2 h再灌注22 h,用10%水合氯醛深度麻醉動(dòng)物后開胸暴露心臟,經(jīng)升主動(dòng)脈插管剪開右心耳,用生理鹽水250m L快速?zèng)_洗,斷頭取腦,在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織MMP-9。免疫組織化學(xué)染色法嚴(yán)格按照說明書實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行,采用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析平均光密度質(zhì),每張隨機(jī)取 5個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。取平均值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.5 腦組織含水量測(cè)定

采用干濕重法。大鼠于缺血再灌注后,濾紙吸干腦組織表面水份,在電子天平上稱得其濕重后即刻置于烤箱,100℃恒溫烘烤24 h至恒重,精確稱量干重,計(jì)算含水量。腦組織含水量 =(濕重 -干重)/濕重 ×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法腦組織 MMP-9表達(dá)(見表 1)

表1 各組 MMP-9的陽性細(xì)胞數(shù)及平均光密度質(zhì)(±s)

表1 各組 MMP-9的陽性細(xì)胞數(shù)及平均光密度質(zhì)(±s)

注:*IR組 、LP組各指標(biāo)與sham組比較均P＜0.05,#LP組與 IR組陽性細(xì)胞數(shù)比較P＜0.05,△平均光密度質(zhì)比較P＜0.05

組別 n 陽性細(xì)胞數(shù) 平均光密度質(zhì)sham組 6 0 0 IR組 8 18.25±7.38* 0.366±0.011*LP組 8 9.88±2.10*# 0.242±0.010*△

表1對(duì)各組的陽性細(xì)胞數(shù)研究顯示,LP組和 IR組腦組織 MMP-9表達(dá)明顯,與 sham陽性細(xì)胞數(shù)比較P＜0.05。LP組與 IR組比較,MMP-9的陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05);平均光密度質(zhì)明顯降低(P＜0.05)。

2.2 番茄紅素對(duì)缺血再灌注后大鼠腦含水量的影響(見表 2)

表2 各組大鼠腦含水量比較(±s) %

表2 各組大鼠腦含水量比較(±s) %

注:*IR組、LP組與sham組比較均P＜0.05,#LP組與IR組比較P＜0.05

組別 n 腦含水量sham組 6 76.63±1.20 IR組 8 81.73±1.19*LP組 8 78.56±1.17*#

表2結(jié)果顯示,IR組、LP組與 sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均(P＜0.05)。LP組與 IR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表明番茄紅素能明顯減少腦缺血再灌注大鼠的腦含水量。

3 討論

MMPs是分解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白酶類中最重要的一類。其中 MMP-9又稱基質(zhì)溶素-9,是基質(zhì)金屬蛋白酶中的重要成員,與腦血管病和血腦屏障的完整性密切相關(guān)。研究證實(shí),在發(fā)生缺血再灌注損傷后,缺血腦組織中 MMP-9表達(dá)會(huì)明顯增高[2,3]。MMP-9損傷血腦屏障后可以引起血管源性腦水腫,從而腦組織發(fā)生重要的病理改變[4]。因此,干預(yù) MMP-9的表達(dá)可以有效地減少缺血再灌注后腦組織的損傷。

番茄紅素(lycopene)是具有極強(qiáng)的清除自由基能力的天然抗氧化劑,近年來的研究表明,番茄紅素可以通過直接淬滅氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體組織抗氧化能力等達(dá)到保護(hù)組織器官的作用。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)番茄紅素有腦保護(hù)作用,其機(jī)制也與其清除自由基有關(guān),可以減輕腦水腫的發(fā)生。有研究表明大鼠腦缺血再灌注后番茄紅素可以減輕腦水腫,降低腦梗死體積,同時(shí)可抑制腦組織中丙二醛的產(chǎn)生。此外,番茄紅素可抑制皮膚、肺和肝組織內(nèi)的 MMP-9表達(dá)[5]。

抗氧化劑能否減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),番茄紅素干預(yù)能使大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注的腦組織中 MMP-9表達(dá)減少(均P＜0.05),腦含水量降低(P＜0.05),提示番茄紅素能通過降低大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注后缺血側(cè)腦組織中 MMP-9的表達(dá)。特別是在血管源性腦水腫發(fā)生的高峰時(shí)期24 h～48 h之間,可以推測(cè)番茄紅素可以通過抑制 MMP-9的產(chǎn)生從而減少腦水腫達(dá)到保護(hù)腦組織。番茄紅素抑制 MMP-9活性的機(jī)制尚不清楚?？赡苡捎?MMP-9基因結(jié)構(gòu)中具有激活劑蛋白-1(AP-1)的結(jié)合位點(diǎn),番茄紅素可通過抑制核轉(zhuǎn)移因子AP-1影響 MMP-9的活性。另有研究認(rèn)為超氧化物歧化酶能減輕腦損傷后 MMP-9的表達(dá)[6],番茄紅素的抗氧化劑清除自由基的作用可能是影響 MMP-9活性的另一原因。機(jī)體組織局部氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí),自由基的產(chǎn)生增多都可以合并有 MMP-9表達(dá)的增加[7]。

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[4] Pefferkom T,Rosenberg CA.Closure of the Blood-Brain by Matrix Metalloproteinase Inhibition Reduces rtPA-Mediated Mortality in Cerebral Ischemia with Delayed Reperfusion[J].Stroke,2003,34(8):2025-2030.

[5] 高元興,秦華東.抗氧化劑在降低肝缺血再灌注損傷中的作用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(5):911.

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