陳吉祥,陳明軍,張尤歷

(江蘇大學附屬醫(yī)院,江蘇鎮(zhèn)江 212001)

近年來的研究發(fā)現(xiàn),人染色體 3p21.3等位缺失與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1],該位點存在腫瘤抑制基因 RASSF1基因家族[2,3]。該家族至少包含 7種不同的轉(zhuǎn)錄本(轉(zhuǎn)錄本A～G)。RASSF1B基因在腫瘤組織和正常組織中都有表達,但其功能尚沒有明確[4]。本研究采用 RT-PCR結(jié)合生物信息學方法對胃癌、肝癌等腫瘤細胞中的 RASSF1B基因進行了克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料 5株腫瘤細胞分別為胃腺癌細胞 AGS、肝癌細胞 HEPG2、高轉(zhuǎn)移肺癌細胞 95D、肺腺癌細胞LTEP-a-2、白血病細胞U937。MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒等。

1.2 細胞培養(yǎng) 將上述 5種腫瘤細胞分別加DMEM及 10%小牛血清,置 CO2培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng)至細胞均勻覆蓋細胞瓶約 3/4。

1.3 RNA的提取、擴增及克隆 以 Trizol提取上述各種細胞的總RNA并純化,用MMLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用DNAstar軟件設計 RASSF1B基因的特異引物,擴增引物為 5′-ATG AGC TTG AAC AAG GAC GG-3′(上游引物)、5′-TCC ACC TGG GGG TAC AAGAGG-3′(下游引物),擴增長度為 591 bp。以人β-actin作內(nèi)參照,引物序列為 5′-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3′(上游引物)、5′-GGC GTA CAG GTC TTT GCG GAT G-3′(下游引物),擴增長度為 512 bp。PCR反應條件:95℃、2 min,94℃、15 s,58℃、30 s,72℃、1.5 min,30個循環(huán),72℃、10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物。將RASSF1B的 PCR產(chǎn)物連接到 T-載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,經(jīng)藍白斑篩選出陽性克隆。

1.4 RASSF1B基因的序列分析 應用生物信息學軟件分析。

2 結(jié)果

分別提取了 5株腫瘤細胞的總 RNA。凝膠電泳結(jié)果顯示,28 S和 18 S條帶較為明顯,RNA的完整性和質(zhì)量較好。核酸檢測儀檢測顯示A260/A280均在 1.9～2.0,與電泳結(jié)果一致。

經(jīng)RT-PCR擴增后,RASSF1B在 5種腫瘤細胞中均有表達,其中在肺腺癌細胞株LTEP-a-2和白血病細胞株 U937中的表達量較高,在其他三種腫瘤細胞中的表達量較少。肺腺癌細胞株LTEP-a-2、白血病細胞株U937、胃腺癌細胞株 AGS、高轉(zhuǎn)移肺癌細胞株 95 D、肝癌細胞株 HEPG2的 RASSF1B mRNA相對表達量分別為 0.62、0.71、0.07、0.22、0.13。

將RASSF1B的 PCR產(chǎn)物連接到 T-載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,經(jīng)藍白斑篩選出陽性克隆。測序結(jié)果表明克隆后的基因全長為 591 bp,其中編碼區(qū)為 570 bp,編碼 189個氨基酸,與網(wǎng)上登錄RASSF1B一致 (Genbank序列號:NM_170712)。應用生物學軟件 ExPASy Proteomics Server對其進行分析,結(jié)果顯示,RASSF1B基因含有一個 Ras結(jié)合區(qū)域(45～139 aa)和一個 SARAH區(qū)域 (143～189 aa)。

3 討論

RASSF1家族是近年來發(fā)現(xiàn)的,目前的研究表明,其不同的轉(zhuǎn)錄剪切本在惡性腫瘤的發(fā)生和誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用,它們能夠直接參與細胞周期的調(diào)控。但其作用機理尚未明確。

有研究表明,在一些基因家族中,各轉(zhuǎn)錄本之間存在協(xié)調(diào)表達,一旦表達平衡被打破,就會導致細胞不正常增殖[5]。因此,在不同的細胞系中分析各轉(zhuǎn)錄本表達比例的變化可以初步推斷各轉(zhuǎn)錄本與腫瘤發(fā)生間的關(guān)系。由于RASSF1家族的轉(zhuǎn)錄本A在正常和癌變的組織中表達差異明顯,故研究較多。其轉(zhuǎn)錄本B在腫瘤組織和正常組織中表達差異不大,被普遍認為是沒有特殊生物學功能的基因,一直沒有受到重視。本研究采用 RT-PCR方法,在 5種腫瘤細胞中擴增出 RASSF1基因,進行測序驗證,發(fā)現(xiàn)在不同的癌變細胞系中,RASSF1B雖都有表達,但表達量存在明顯的差異,在肺癌細胞系及白血病細胞系中表達量高。而在這幾種腫瘤細胞系中并未明顯地擴增出轉(zhuǎn)錄本 A的片段,提示 RASSF1B的表達量可能與腫瘤的類型有關(guān),其在不同種類的癌變細胞中所起的作用可能不同。

生物信息學分析發(fā)現(xiàn),RASSF1B含有一個 Ras結(jié)合區(qū)域和一個 SARAH區(qū)域。Ras區(qū)域是該家族共有的區(qū)域。Ras通路是所有細胞都具有的一條高度保守的信號傳遞通路。Ras蛋白在有活性的 GTP結(jié)合構(gòu)象和無活性的 GDP結(jié)合構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化,與不同的效應物分子激活多條信號傳遞通路。有文獻[6]報道,RASSF1B是通過 Ras區(qū)域以 GTP方式直接與Ha-Ras相結(jié)合。SARAH區(qū)域可以調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導[7]。活化的Ras蛋白具有促進細胞生長增殖的作用,RASSF1B基因可能通過 GTP方式直接與Ha-Ras相結(jié)合,通過抑制 Ras的激活途徑而抑制細胞生長、促進細胞凋亡;RASSF1B能通過阻斷 Cyclin D1的積累及細胞周期 G1/S期的進展而抑制腫瘤生長[8]。需進一步通過 RNA干擾等方法,抑制RASSF1B基因的表達,然后分析細胞的生長狀態(tài),以明確該基因與細胞增殖間的關(guān)系。

[1]安錦霞,楊永秀,黎衛(wèi)平,等.RASSF1A基因在宮頸癌組織中的表達及意義[J].國外醫(yī)學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2005, 11(3):258-260.

[2]Reinhard D,Chun L,Jung-Hoon Y,et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumor suppressorlocus 3p21.3[J].Nat Gene,2000,25(3):315-319.

[3]VavvasD,LiV,Avruch J,et al.Identification ofNorell as a potential Ras effector[J].Biol Chem,1998,273(10):5439-5442.

[4]陳勇軍,鄒聲泉.RASSF 1基因研究進展[J].國外醫(yī)學:遺傳學分冊,2004,27(3):155-158.

[5]WangW,Ji P,Steffen B,et al.Alterations of lymphoid enhancer factor-1 isoform expression in solid tumors and acute leukemias[J].Acta Biochim Biophys Sin,2005,37(3):173-180.

[6]Burbee D,Forgacs E,Zechbauer-Mitller S,et al.The RASSF IA locus in the 3p21.3 homozygous deletion region:epigenefic inactivation in lung and breast cancer and suppression ofmalignant phenotype[J]. Natl Cancer Inst,2001,91(9):691-699.

[7]張劍英,李智.RASSF1基因與腫瘤的關(guān)系[J].國外醫(yī)學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(2):120-122.

[8]Polesello C,Huels mann S,Brown N,et al.The drosophila RASSF homolog antagonizes the hippo pathway[J].Curr Biol,2006,16 (24):2459-2465.