陳順平 余英豪

現(xiàn)行的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術(shù)操作較為繁瑣且實(shí)驗(yàn)結(jié)果較不穩(wěn)定,我們結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn),對(duì)FISH的操作進(jìn)行改進(jìn),應(yīng)用過(guò)程中獲得了良好雜交效果,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

來(lái)源于 55例本院病理科組織蠟塊標(biāo)本,其中非小細(xì)胞肺癌(檢測(cè) EGFR基因)標(biāo)本為 35例,浸潤(rùn)性乳腺癌(檢測(cè) HER-2基因)標(biāo)本為 20例。主要試劑有酸性亞硫酸鈉(美國(guó) Simga產(chǎn)品),蛋白酶 K(美國(guó)羅氏),探針:GLP EGFR/CSP探針和 GLP HER-2/CSP17探針由北京金菩嘉公司提供。主要儀器有 Olympus BX 51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

①將 3μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水,用紙巾吸取多余的水分。②50℃下用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40min。③室溫下用 2×SSC×3m in×2次漂洗。④在組織上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃預(yù)熱的孵育盒中消化 25～35min。⑤室溫下用 2×SSC×3min×2次漂洗,乙醇梯度脫水固定,自然干燥。⑥避光環(huán)境中,玻片和探針混合液(7μl雜交緩沖液、1μl去離子水和 2μl探針),探針混合液滴于雜交區(qū)域,在溫度 83℃的自動(dòng)雜交儀中變性 6m in后置 37℃過(guò)夜雜交。⑦洗滌:第 2日移去蓋玻片,在溫度 46℃,,玻片置于 2×SSC×10min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5min。玻片干燥后加 DAPI復(fù)染液,放于暗盒中復(fù)染數(shù)分鐘后用 OL YMPUSBX 51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號(hào)。

1.3 結(jié)果判定

紅色信號(hào)代表檢測(cè)的靶基因,綠色信號(hào)代表靶基因所在的染色體著絲粒。檢測(cè) EGFR基因計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞,統(tǒng)計(jì) Ratio值(100個(gè)細(xì)胞核中紅色信號(hào)數(shù)/100個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào)數(shù)),FISH陽(yáng)性:(1)EGFR基因擴(kuò)增 ①Ratio≥2為陽(yáng)性結(jié)果;②≥15個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的 10%以上;③出現(xiàn)成團(tuán)紅色信號(hào)的細(xì)胞。(2)高多體性 Ratio＜2,但≥4個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的 40%以上。檢測(cè) HER-2基因計(jì)數(shù) 30個(gè),Ratio＜1.8為陰性結(jié)果,Ratio＞2.2為陽(yáng)性結(jié)果,Ratio在 1.8～2.2之間時(shí),可以選擇增加計(jì)數(shù)或重做。

2 結(jié)果

55例病理蠟塊標(biāo)本中 48例一次性雜交成功,且雜交成功率為 87.3%。其中 2例消化不夠,在 DAPI通道控制下,延長(zhǎng)了消化時(shí)間,全部雜交成功。有 5例信號(hào)點(diǎn)較弱,但不影響判斷。

3 討論

FISH技術(shù)是近幾年生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)廣泛用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)[1]。然而,FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為不穩(wěn)定性且操作繁瑣。通過(guò)實(shí)踐,我們對(duì)病理組織進(jìn)行 FISH檢測(cè)的體會(huì)主要有以下幾點(diǎn):①酶消化方法。我們?nèi)∠藝?guó)內(nèi) FISH現(xiàn)行的浸入消化,采用自己配制的即用型的蛋白酶 K滴入組織區(qū)域消化,37℃溫箱孵育,實(shí)驗(yàn)取得良好的效果,克服浸入消化的不均一性。蛋白酶K容易沉淀,應(yīng)及時(shí)混勻,浸入消化容易使組織標(biāo)本上下區(qū)域消化不均,前后的標(biāo)本消化不均,特別是標(biāo)本量較大的時(shí)候,且酶用量大,成本較高,操作也繁瑣。②在洗滌方面,將 2×SSC×10min代替了現(xiàn)行的 3遍 50%甲酰胺洗滌,對(duì)結(jié)果判斷無(wú)影響,節(jié)約了時(shí)間和成本,避免了甲酰胺對(duì)身體的損害。③組織細(xì)胞類(lèi)型較為復(fù)雜且大部分還伴隨大量纖維,消化效果較難于控制。在進(jìn)行雜交之前應(yīng)在組織上滴加 DAPI復(fù)染液,在熒光顯微鏡下判斷消化效果,組織中被雜交細(xì)胞在 RHOD和FITC的通道下,細(xì)胞核應(yīng)為薄紗狀,亮度一般,DAPI通道下細(xì)胞核膜應(yīng)完整,顏色深淺適中,背景清晰,核外無(wú)過(guò)多雜質(zhì)[2]。④判斷細(xì)胞消化時(shí),我們認(rèn)為 RHOD和FITC、DAPI三通道應(yīng)聯(lián)合判斷細(xì)胞消化效果,DAPI通道可作為判斷細(xì)胞是否消化過(guò)頭的首選通道,而 RHOD和 FITC的通道可作為判斷細(xì)胞消化是否合適。⑤石蠟切片預(yù)處理過(guò)程很重要,每一次實(shí)驗(yàn)時(shí)間跟溫度要統(tǒng)一,一般 50℃用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40min,時(shí)間太長(zhǎng)或太短不利于酶消化時(shí)間的控制。⑥石蠟切片厚度一般為3μm較佳,切片過(guò)厚細(xì)胞容易聚集一起,極易造成各個(gè)細(xì)胞信號(hào)計(jì)數(shù)困難,且切片越厚預(yù)處理時(shí)間和消化時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)才不影響探針結(jié)合,使結(jié)果較為穩(wěn)定。

[1] 王泊沄.病理學(xué)技術(shù)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:595.

[2] 陳順平.FISH中酶消化細(xì)胞的幾點(diǎn)體會(huì)〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2010,26(1):116.