穆小婷 韓文節(jié) 歐志鵬 華四妹 陳智標(biāo) 謝衛(wèi)兵 廖偵成

1（清遠(yuǎn)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，廣東清遠(yuǎn) 511500）

2（清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心，廣東清遠(yuǎn) 511500）

孔雀石綠和結(jié)晶紫屬于人工合成的三苯甲烷類堿性工業(yè)染料，主要用來預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鍶霉病、寄生蟲病、小瓜蟲病、指環(huán)蟲病、斜管蟲病、三代蟲病及其他一些細(xì)菌性疾病等，也可用于水產(chǎn)品的輸入和水產(chǎn)品暫養(yǎng)等過程，以延長水產(chǎn)品特別是魚類產(chǎn)品的存活時(shí)間?？兹甘G和結(jié)晶紫被魚類吸收后，會代謝還原為脂溶性的隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫，在魚類的脂肪組織中穩(wěn)定殘留，其化學(xué)官能團(tuán)“三苯甲烷”被證明具有高毒、高殘留、致癌、致畸、致突變等毒副作用，危害食用者身體健康，同時(shí)含有孔雀石綠和結(jié)晶紫的廢水排放會污染水環(huán)境。目前針對孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量檢測方法主要有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法及一些速測技術(shù)，國內(nèi)常用標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 19857—2005、GB/T 20361—2006、SC/T 3021—2004 等，但均存在前處理復(fù)雜繁瑣、所用試劑及前處理儀器多等缺點(diǎn)。本方法前處理只用一種提取劑，提取步驟相對簡單，且所用試劑使用種類和數(shù)量少，大大減少了對環(huán)境的污染。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

乙腈，液相色譜純，德國默克公司；甲酸，優(yōu)級純，美國ACS 恩科化學(xué)；乙酸銨，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇，液相色譜純，德國默克公司；孔雀石綠草酸鹽溶液，100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；隱色孔雀石綠溶液，100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；結(jié)晶紫溶液，100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；隱色結(jié)晶紫溶液，100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；孔雀石綠-D5，50 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；隱色孔雀石綠-D6，50 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；微孔濾膜，0.22 μm，安捷倫公司；中性氧化鋁小柱，1 g/6mL，Waters 公司。

電子天平，120 g/0.1mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；漩渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；超純水機(jī)，德國默克公司；KQ-600E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；固相萃取裝置，上海熙揚(yáng)儀器有限公司。

1.2 前處理方法

準(zhǔn)確稱取5.00 g 待檢水產(chǎn)品于50 mL 離心管中，加1.0 μg/mL的孔雀石綠-D5 和隱色孔雀石綠-D6 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL 作為內(nèi)標(biāo)，旋渦混合30 s，加10 mL 乙腈提取，旋渦振蕩1 min，超聲（頻率：40 KHz）提取10 min，4 000 r/min 離心5 min，將上清液移入15 mL 離心管備用；將中性氧化鋁小柱安裝在固相萃取柱上，用5 mL 乙腈活化，取離心后的上清液5 mL 到已活化好的中性氧化鋁柱，收集流出液，過孔徑0.22 μm 濾膜于10 mL 的干凈離心管中，分別取0.5 mL 濾液和0.5 mL 超純水到上機(jī)瓶，搖勻，供高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。同時(shí)做空白試驗(yàn)，空白試樣中不含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的空白水產(chǎn)品樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑和凈化柱的選擇

目前檢測水產(chǎn)品中殘留的孔雀石綠、結(jié)晶紫時(shí)，常使用的提取劑包括乙酸銨緩沖液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等，輔助提取劑對甲苯磺酸、鹽酸羥胺等，而乙腈被公認(rèn)為是提取孔雀石綠的最佳溶劑。張藝蓓等研究發(fā)現(xiàn)，隱色孔雀石綠在乙腈中的溶解度要高于甲醇，且根據(jù)試驗(yàn)可知，若提取時(shí)加入緩沖鹽或離子對試劑等，需用二氯甲烷溶液進(jìn)行萃取凈化，因水與二氯甲烷屬于共軛溶液，較難或需較長時(shí)間離心才能分層。本研究綜合考慮后選擇乙腈作為提取劑，一方面可提高對目標(biāo)物的提取效率，同時(shí)減少溶液因多次轉(zhuǎn)移造成損失。目前常見的凈化柱包括氧化鋁柱、PRS 柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱等，因酸性氧化鋁柱經(jīng)過乙腈活化后對脂肪的吸附能力變?nèi)?，而堿性氧化鋁柱對孔雀石綠有吸附作用而易導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，所以實(shí)驗(yàn)優(yōu)先選用中性氧化鋁小柱。左舜宇等通過對中性氧化鋁柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱凈化效果比對試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中性氧化鋁小柱凈化效果最好。本試驗(yàn)最終采用中性氧化鋁柱進(jìn)行待測物的凈化。

下頁 圖1～圖6 為待測物及內(nèi)標(biāo)物的定性定量離子色譜圖。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限試驗(yàn)

本試驗(yàn)以羅氏蝦為測定樣品，選0 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100.0 μg/kg 9 個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測結(jié)果顯示，孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結(jié)晶紫（CV）、隱色結(jié)晶紫（LCV）標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=1.039x -0.871、y=1.002x -0.051、y=1.015x-0.343、y=0.981x+0.410，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.998 5、0.999 5、0.999 5、0.999 5，均滿足國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中附錄F（檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求）相關(guān)系數(shù)不低于0.98 的要求。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫4 種檢測指標(biāo)在GB/T 19857—2005 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法中檢出限均為0.5 μg/kg，在GB/T 19857—2005 高效液相色譜法中檢出限均為2.0 μg/kg，在GB/T 20361—2006 高效液相色譜熒光檢測法中均為0.50 μg/kg，本試驗(yàn)根據(jù)3 倍信噪比來計(jì)算檢出限，由結(jié)果可知，4 種檢測指標(biāo)檢出限均可達(dá)到0.5 μg/kg。

圖1 孔雀石綠定性定量離子色譜圖

圖2 隱色孔雀石綠定性定量離子色譜圖

圖3 結(jié)晶紫定性定量離子色譜圖

圖4 隱色結(jié)晶紫定性定量離子色譜圖

圖5 孔雀石綠-D5離子色譜圖

圖6 隱色孔雀石綠-D6離子色譜圖

2.3 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)以國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857—2005 中方法測定低限為基礎(chǔ)，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008 附錄F 中檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求為試驗(yàn)依據(jù)，選取有代表性的草魚和羅氏蝦為測定樣品，在方法測定低限（0.5 μg/kg）、2 倍方法測定低限（1.0 μg/kg）、10倍方法測定低限（5.0 μg/kg）進(jìn)行三水平試驗(yàn)，結(jié)果分別見表1、表2。

表1 草魚中4 種待測物回收率及精密度

表2 羅氏蝦中4 種待測物回收率及精密度

由表1、表2 結(jié)果可知，方法回收率在87.30%～119.20%之間，可達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

本試驗(yàn)提取過程只需一種提取劑，凈化后過孔徑0.22 μm 微孔濾膜后即可上機(jī)，不需要進(jìn)行氮?dú)鉂饪s處理，大大簡化了樣品前處理步驟，結(jié)果表明，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出低限、回收率、精密度等各檢測技術(shù)指標(biāo)同時(shí)可滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中附錄F（檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求）要求。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡單快速，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的大批量檢測，具體優(yōu)勢包括以下幾個(gè)方面：方法前處理提取過程需一種提取劑乙腈，極大地簡化了提取過程，同時(shí)減少了溶液因多次轉(zhuǎn)移造成的損失；方法前處理凈化過程只需過柱后再過0.22 μm 微孔濾膜即可上機(jī)檢測，檢出限和回收率等相關(guān)參數(shù)均可達(dá)到國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，不需再進(jìn)行濃縮凈化，既簡化了步驟，又省去了試劑和氮吹等復(fù)雜儀器的使用；方法中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫4 種檢測指標(biāo)可一同進(jìn)行分析檢測；方法采用曲線和樣品一同進(jìn)行前處理的內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，保證曲線和樣品始終在同一條件下進(jìn)行處理，有效降低了前處理操作過程中的操作誤差和其他條件導(dǎo)致的不統(tǒng)一性及基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響。